Die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) ist die Standardmethode, um Forschungspeptide Rest f\u00fcr Rest auf einem festen Harztr\u00e4ger aufzubauen. Fr\u00fchere Artikel in diesem Blog behandelten die Bausteine dieses Prozesses: Schutzgruppen, Harzwahl, Kupplungsreagenzien und die Abspaltung, die das Rohpeptid vom Harz freisetzt. Implizit bleibt in dieser Kette, dass die SPPS eine praktische L\u00e4ngenbegrenzung hat. Je l\u00e4nger eine Kette w\u00e4chst, desto mehr h\u00e4ufen sich unvollst\u00e4ndige Kupplungen, Deletionssequenzen und Aggregation der wachsenden Peptidkette am Harz. Jenseits von etwa 50 Aminos\u00e4uren wird die Wahrscheinlichkeit eines homogenen Endprodukts statistisch immer geringer, selbst mit einem optimierten Protokoll.<\/p>\n
F\u00fcr die Forschung an l\u00e4ngeren Forschungspeptiden und kleinen Proteinen ist das ein echter Engpass. Die in der Literatur erarbeitete L\u00f6sung ist nicht eine l\u00e4ngere Synthese, sondern das chemische Verbinden mehrerer k\u00fcrzerer Fragmente, die jeweils per SPPS hergestellt werden. Die daf\u00fcr am weitesten verbreitete Technik ist die native chemische Ligation (NCL).<\/p>\n
Die NCL, urspr\u00fcnglich in den 1990er Jahren von der Forschungsgruppe um Stephen Kent beschrieben, nutzt zwei ungesch\u00fctzte Peptidfragmente, die in w\u00e4ssrigem Puffer bei neutralem pH-Wert chemoselektiv miteinander reagieren. Ein Fragment tr\u00e4gt an seinem C-Terminus einen Thioester, das andere hat an seinem N-Terminus ein freies Cystein. Da beide Fragmente vollst\u00e4ndig ungesch\u00fctzt sind, ist nach der Ligation selbst kein separater Entsch\u00fctzungsschritt erforderlich, was den Prozess im Vergleich zur klassischen Fragmentkondensation deutlich vereinfacht.<\/p>\n
Die Reaktion l\u00e4uft in zwei Schritten ab. Zun\u00e4chst findet eine Transthioesterifizierung statt: Die Thiolgruppe des Cysteins greift den Thioester an und bildet an der Ligationsstelle einen neuen, tempor\u00e4ren Thioester als Zwischenprodukt. Dieses Zwischenprodukt durchl\u00e4uft anschlie\u00dfend eine intramolekulare S\u2192N-Acylwanderung, bei der die Acylgruppe vom Schwefel auf die Aminogruppe desselben Cysteins wandert. Das Ergebnis ist eine native Amidbindung \u2013 chemisch nicht von einer Peptidbindung zu unterscheiden, die bei einer gew\u00f6hnlichen SPPS-Kupplung entsteht.<\/p>\n
Jedes Fragment wird separat per Standard-Fmoc-SPPS aufgebaut und aufgereinigt, genau wie in diesem Blog zuvor f\u00fcr k\u00fcrzere Peptide beschrieben. Das C-terminale Fragment wird w\u00e4hrend oder nach der Synthese in einen Thioester umgewandelt, w\u00e4hrend das N-terminale Fragment des n\u00e4chsten Segments ein Cystein an der ersten Position ben\u00f6tigt. F\u00fcr Forschungszwecke, die \u00fcber das hinausgehen, was zwei Fragmente abdecken k\u00f6nnen \u2013 Zielproteine von etwa einhundert bis zweihundertf\u00fcnfzig Aminos\u00e4uren \u2013, werden mehrere Ligationen hintereinander (sequenziell) oder von einem zentralen Fragment aus (konvergent) durchgef\u00fchrt. Das erfordert eine strikte Reihenfolge von Entsch\u00fctzungs- und Ligationsschritten, denn jedes Fragment darf nur einmal als reaktiver Partner auftreten, bevor die n\u00e4chste Kupplung an die Reihe kommt.<\/p>\n
Die gr\u00f6\u00dfte praktische Einschr\u00e4nkung der klassischen NCL ist das Erfordernis eines Cysteins an jeder Ligationsstelle. Nicht jede Forschungssequenz hat dort von Natur aus ein Cystein, und der Einbau eines zus\u00e4tzlichen Cysteins kann die Eigenschaften des Untersuchungsobjekts ver\u00e4ndern. Die Literatur beschreibt daher entfernbare Thiol-Hilfsgruppen und modifizierte Aminos\u00e4uren, die die Reaktivit\u00e4t von Cystein nachahmen und nach der Ligation wieder entfernt werden k\u00f6nnen, sodass die urspr\u00fcngliche Sequenz erhalten bleibt.<\/p>\n
Die Reaktionsbedingungen sind ebenso kritisch. Der Ligationspuffer wird \u00fcblicherweise bei pH 7 gehalten und enth\u00e4lt einen Thiolkatalysator wie MPAA, der den Thioesteraustausch beschleunigt und verhindert, dass das Zwischenprodukt stehen bleibt. Sauerstoff wird so weit wie m\u00f6glich ausgeschlossen, da freie Thiolgruppen sonst zu unerw\u00fcnschten Disulfidbr\u00fccken oxidieren und die Ligationsausbeute senken w\u00fcrden. Nach Abschluss der Ligation folgt in der Regel ein weiterer Aufreinigungsschritt per pr\u00e4parativer RP-HPLC, der nicht umgesetztes Fragment vom Ligationsprodukt trennt.<\/p>\n
Die native chemische Ligation hat in der Peptidchemie die T\u00fcr zu Forschungsmaterial ge\u00f6ffnet, das \u00fcber die klassische SPPS nicht zug\u00e4nglich war: l\u00e4ngere synthetische Ketten und sogar vollst\u00e4ndig synthetische kleine Proteine, aufgebaut aus Teilst\u00fccken, von denen jedes f\u00fcr sich gut gepr\u00fcft und aufgereinigt werden kann. F\u00fcr Labore, die mit derartigen Konstrukten arbeiten, bedeutet das eine zus\u00e4tzliche Planungsebene \u2013 welche Fragmente, welche Ligationsstellen, welche Reihenfolge \u2013 \u00fcber die Synthese und Aufreinigung hinaus, die f\u00fcr jedes einzelne Fragment ohnehin erforderlich ist.<\/p>\n
Diese Informationen sind ausschlie\u00dflich f\u00fcr Labor- und Forschungszwecke bestimmt. Die Produkte und Informationen von Dutch Peptide Labs sind nicht zur Anwendung am Menschen oder Tier und nicht f\u00fcr diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Warum die SPPS nicht unbegrenzt skaliert Die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) ist die Standardmethode, um Forschungspeptide Rest f\u00fcr Rest auf einem festen Harztr\u00e4ger aufzubauen. Fr\u00fchere Artikel in diesem Blog behandelten die Bausteine dieses Prozesses: Schutzgruppen, Harzwahl, Kupplungsreagenzien und die Abspaltung, die das Rohpeptid vom Harz freisetzt. Implizit bleibt in dieser Kette, dass die SPPS eine praktische L\u00e4ngenbegrenzung […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[232],"tags":[],"class_list":["post-554","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-de"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/554","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=554"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/554\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81643,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/554\/revisions\/81643"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=554"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=554"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/de\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=554"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}