Eine Bestimmung der intakten Masse per LC-MS best\u00e4tigt, dass ein Forschungspeptid das richtige Molekulargewicht hat, sagt aber wenig \u00fcber die genaue Reihenfolge der darin enthaltenen Aminos\u00e4uren aus. Zwei Peptide mit identischer Masse k\u00f6nnen durch einen Austausch von Resten v\u00f6llig unterschiedliche Sequenzen haben. Peptide Mapping ist die Technik, die diese Unterscheidung sehr wohl leisten kann: Sie zerlegt ein Peptid in kleinere, gut analysierbare Fragmente und bestimmt dabei die vollst\u00e4ndige Sequenz. F\u00fcr die Qualit\u00e4tskontrolle von Forschungspeptiden ist sie eine wertvolle Erg\u00e4nzung zu Analysen der intakten Masse und der Reinheit.<\/p>\n
Ein Massenspektrometer misst das Molekulargewicht eines intakten Peptids mit hoher Genauigkeit, und in Kombination mit der RP-HPLC-Retentionszeit ergibt das einen starken Hinweis auf die Identit\u00e4t. Dennoch gibt es Szenarien, in denen dies keine ausreichende Sicherheit bietet: isobare Aminos\u00e4uresubstitutionen (etwa Leucin und Isoleucin, die exakt dieselbe Masse haben), Vertauschungen zweier Reste, die zusammen dieselbe Masse ergeben wie ein anderes Paar, oder eine Deletion, die zuf\u00e4llig durch eine andere Abweichung ausgeglichen wird. In diesen F\u00e4llen zeigt die intakte Masse keinen Sequenzfehler, w\u00e4hrend die tats\u00e4chliche Aminos\u00e4urereihenfolge von der beabsichtigten Sequenz abweicht. Peptide Mapping wurde entwickelt, um genau solche verborgenen Abweichungen zu erkennen, indem das Peptid auf Sequenzebene und nicht als einzelnes Ganzes untersucht wird.<\/p>\n
Der erste Schritt im Peptide Mapping ist die Fragmentierung des Forschungspeptids an vorhersagbaren Stellen. Die enzymatische Verdauung mit Proteasen wie Trypsin (spaltet nach Lysin und Arginin) oder Glu-C (spaltet nach Glutamins\u00e4ure) ist der am weitesten verbreitete Ansatz, da diese Enzyme hochspezifisch und reproduzierbar schneiden. F\u00fcr Peptide, die keine geeigneten Trypsin- oder Glu-C-Stellen enthalten, oder f\u00fcr eine gezielte Strukturaufkl\u00e4rung wird stattdessen manchmal eine chemische Verdauung eingesetzt, etwa die Spaltung mit Bromcyan (CNBr) an Methioninresten. Die Wahl der Verdauungsmethode h\u00e4ngt stark von der Aminos\u00e4urezusammensetzung des jeweiligen Forschungspeptids ab: Eine Sequenz ohne Lysin oder Arginin erfordert ein anderes Enzym oder einen chemischen Weg als ein lysinreiches Peptid.<\/p>\n
Nach der Verdauung wird das Fragmentgemisch per Umkehrphasen-HPLC getrennt, gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS\/MS). Von jedem Fragment wird zun\u00e4chst die Masse bestimmt (MS1); anschlie\u00dfend wird es im Ger\u00e4t weiter fragmentiert (MS2), wobei die entstehenden Kollisionsfragmente die Aminos\u00e4urereihenfolge innerhalb dieses Peptidst\u00fccks offenlegen. Durch den Vergleich der gemessenen Fragmentmassen mit den theoretisch erwarteten Fragmenten der beabsichtigten Sequenz erh\u00e4lt man eine \u201eSequenzabdeckung\u201c: den Prozentsatz der Sequenz, der experimentell tats\u00e4chlich best\u00e4tigt wurde. Eine vollst\u00e4ndige oder nahezu vollst\u00e4ndige Abdeckung gibt deutlich mehr Sicherheit \u00fcber die Sequenzintegrit\u00e4t, als eine einzelne Messung der intakten Masse allein bieten kann.<\/p>\n
Im Rahmen der Qualit\u00e4tskontrolle von Forschungspeptiden wird Peptide Mapping vor allem als orthogonale Best\u00e4tigung neben der \u00fcblichen Kombination aus RP-HPLC-Reinheit und Massenspektrometrie der intakten Masse eingesetzt, insbesondere bei l\u00e4ngeren Sequenzen, Peptiden mit mehreren modifizierten Resten oder wenn fr\u00fchere Analysen ein uneindeutiges Ergebnis geliefert haben. Die ver\u00f6ffentlichte Methodenliteratur beschreibt Peptide Mapping mittels chemischer Verdauung und MALDI-MS als etablierten Ansatz zur Sequenzbest\u00e4tigung in der Protein- und Peptidcharakterisierung, und dieselben Prinzipien gelten f\u00fcr synthetische Forschungspeptide. F\u00fcr die routinem\u00e4\u00dfige Chargenfreigabe ist die Methode arbeitsintensiver als eine Standardpr\u00fcfung des CoA, weshalb sie eher der gezielten Identit\u00e4tsbest\u00e4tigung vorbehalten ist, statt bei jeder produzierten Charge eingesetzt zu werden.<\/p>\n
Eine unvollst\u00e4ndige Sequenzabdeckung bedeutet nicht automatisch einen Sequenzfehler: Manche Fragmente sind zu klein oder zu hydrophil, um auf der HPLC-S\u00e4ule gut zur\u00fcckgehalten zu werden, und k\u00f6nnen daher verloren gehen, bevor sie das Massenspektrometer erreichen. Forschende, die Peptide Mapping anwenden oder durchf\u00fchren lassen, ber\u00fccksichtigen dies, indem sie die Verdauungsstrategie auf die jeweilige Sequenz abstimmen und mehrere Enzyme kombinieren, wenn ein einzelnes Enzym eine unzureichende Abdeckung liefert. So entsteht ein vollst\u00e4ndigeres und zuverl\u00e4ssigeres Bild der tats\u00e4chlichen Aminos\u00e4urereihenfolge des Forschungsmaterials.<\/p>\n
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