La s\u00edntesis de p\u00e9ptidos en fase s\u00f3lida (SPPS) es el m\u00e9todo est\u00e1ndar para construir p\u00e9ptidos de investigaci\u00f3n, residuo a residuo, sobre un soporte s\u00f3lido de resina. En art\u00edculos anteriores de este blog se trataron los elementos de ese proceso: grupos protectores, elecci\u00f3n de la resina, reactivos de acoplamiento y la escisi\u00f3n que libera el p\u00e9ptido bruto de la resina. Lo que queda impl\u00edcito en esa cadena es que la SPPS tiene un l\u00edmite pr\u00e1ctico de longitud. A medida que la cadena se alarga, se acumulan acoplamientos incompletos, secuencias de deleci\u00f3n y agregaci\u00f3n en la resina de la cadena pept\u00eddica en crecimiento. Por encima de unos 50 amino\u00e1cidos, la probabilidad de obtener un producto final homog\u00e9neo se reduce estad\u00edsticamente cada vez m\u00e1s, incluso con un protocolo optimizado.<\/p>\n
Para la investigaci\u00f3n sobre p\u00e9ptidos de investigaci\u00f3n m\u00e1s largos y prote\u00ednas peque\u00f1as, esto supone un verdadero cuello de botella. La soluci\u00f3n desarrollada en la bibliograf\u00eda no es una s\u00edntesis m\u00e1s larga, sino la uni\u00f3n qu\u00edmica de varios fragmentos m\u00e1s cortos, cada uno obtenido mediante SPPS. La t\u00e9cnica m\u00e1s utilizada para ello es la ligaci\u00f3n qu\u00edmica nativa (NCL).<\/p>\n
La NCL, descrita originalmente por el grupo de investigaci\u00f3n de Stephen Kent en la d\u00e9cada de 1990, utiliza dos fragmentos pept\u00eddicos no protegidos que reaccionan entre s\u00ed de forma quimioselectiva en tamp\u00f3n acuoso a pH neutro. Un fragmento lleva un tio\u00e9ster en su extremo C-terminal y el otro tiene una ciste\u00edna libre en su extremo N-terminal. Como ambos fragmentos est\u00e1n totalmente desprotegidos, no es necesario un paso de desprotecci\u00f3n aparte despu\u00e9s de la propia ligaci\u00f3n, lo que simplifica mucho el proceso en comparaci\u00f3n con la condensaci\u00f3n de fragmentos cl\u00e1sica.<\/p>\n
La reacci\u00f3n transcurre en dos etapas. Primero se produce una transtioesterificaci\u00f3n: el grupo tiol de la ciste\u00edna ataca al tio\u00e9ster y forma un nuevo intermedio tio\u00e9ster temporal en el sitio de ligaci\u00f3n. A continuaci\u00f3n, ese intermedio experimenta una migraci\u00f3n intramolecular del grupo acilo de S a N, en la que el grupo acilo migra del azufre al grupo amino de la misma ciste\u00edna. El resultado es un enlace amida nativo, qu\u00edmicamente indistinguible de un enlace pept\u00eddico formado durante un acoplamiento ordinario de SPPS.<\/p>\n
Cada fragmento se construye y se purifica por separado mediante Fmoc-SPPS est\u00e1ndar, exactamente como se ha descrito anteriormente en este blog para p\u00e9ptidos m\u00e1s cortos. El fragmento C-terminal se convierte en tio\u00e9ster durante la s\u00edntesis o despu\u00e9s de ella, mientras que el fragmento N-terminal del siguiente segmento requiere una ciste\u00edna en la primera posici\u00f3n. Para fines de investigaci\u00f3n que van m\u00e1s all\u00e1 de lo que pueden cubrir dos fragmentos \u2014prote\u00ednas diana de aproximadamente cien a doscientos cincuenta amino\u00e1cidos\u2014, se llevan a cabo varias ligaciones una tras otra (de forma secuencial) o a partir de un fragmento central (de forma convergente). Esto exige un orden estricto de los pasos de desprotecci\u00f3n y ligaci\u00f3n, porque cada fragmento solo puede actuar una vez como compa\u00f1ero de reacci\u00f3n antes de que llegue el turno del siguiente acoplamiento.<\/p>\n
La mayor limitaci\u00f3n pr\u00e1ctica de la NCL cl\u00e1sica es la necesidad de una ciste\u00edna en cada sitio de ligaci\u00f3n. No todas las secuencias de investigaci\u00f3n tienen de forma natural una ciste\u00edna en ese punto, e introducir una ciste\u00edna adicional puede modificar las propiedades del objeto de estudio. Por ello, la bibliograf\u00eda describe grupos auxiliares tiol eliminables y amino\u00e1cidos modificados que imitan la reactividad de la ciste\u00edna y pueden eliminarse de nuevo tras la ligaci\u00f3n, de modo que se conserve la secuencia original.<\/p>\n
Las condiciones de reacci\u00f3n son igualmente cr\u00edticas. El tamp\u00f3n de ligaci\u00f3n suele mantenerse a pH 7 y contiene un catalizador ti\u00f3lico, como el MPAA, que acelera el intercambio de tio\u00e9ster e impide que el intermedio se estanque. El ox\u00edgeno se excluye en la medida de lo posible, porque de lo contrario los grupos tiol libres se oxidar\u00edan formando puentes disulfuro no deseados, lo que reducir\u00eda el rendimiento de la ligaci\u00f3n. Una vez completada la ligaci\u00f3n, suele seguir un paso de purificaci\u00f3n adicional mediante RP-HPLC preparativa, que separa el fragmento sin reaccionar del producto de ligaci\u00f3n.<\/p>\n
La ligaci\u00f3n qu\u00edmica nativa ha abierto la puerta en la qu\u00edmica de p\u00e9ptidos a material de investigaci\u00f3n que era inaccesible mediante la SPPS cl\u00e1sica: cadenas sint\u00e9ticas m\u00e1s largas e incluso prote\u00ednas peque\u00f1as totalmente sint\u00e9ticas, construidas a partir de piezas que pueden controlarse y purificarse bien por separado. Para los laboratorios que trabajan con construcciones de este tipo, esto supone un nivel adicional de planificaci\u00f3n \u2014qu\u00e9 fragmentos, qu\u00e9 sitios de ligaci\u00f3n, qu\u00e9 orden\u2014 adem\u00e1s de la s\u00edntesis y la purificaci\u00f3n ya necesarias para cada fragmento individual.<\/p>\n
Esta informaci\u00f3n est\u00e1 destinada exclusivamente a fines de laboratorio e investigaci\u00f3n. Los productos y la informaci\u00f3n de Dutch Peptide Labs no est\u00e1n destinados al uso en personas ni en animales, ni a aplicaciones diagn\u00f3sticas o terap\u00e9uticas.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Por qu\u00e9 la SPPS no puede ampliarse indefinidamente La s\u00edntesis de p\u00e9ptidos en fase s\u00f3lida (SPPS) es el m\u00e9todo est\u00e1ndar para construir p\u00e9ptidos de investigaci\u00f3n, residuo a residuo, sobre un soporte s\u00f3lido de resina. En art\u00edculos anteriores de este blog se trataron los elementos de ese proceso: grupos protectores, elecci\u00f3n de la resina, reactivos de […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[254],"tags":[],"class_list":["post-1065","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-es"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1065","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1065"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1065\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81736,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1065\/revisions\/81736"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1065"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1065"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/es\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1065"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}