Lorsqu’un peptide de recherche a franchi la purification par HPLC pr\u00e9parative et l’\u00e9change de contre-ion, une question cruciale demeure\u00a0: le pourcentage de puret\u00e9 indiqu\u00e9 est-il r\u00e9ellement exact\u00a0? La RP-HPLC est la norme du secteur, mais aucune technique de s\u00e9paration n’est infaillible. L’\u00e9lectrophor\u00e8se capillaire (CE) offre un contr\u00f4le orthogonal capable de r\u00e9v\u00e9ler les angles morts de la chromatographie \u2014 et m\u00e9rite une place fixe dans la bo\u00eete \u00e0 outils analytique de tout laboratoire de recherche travaillant avec des peptides synth\u00e9tiques.<\/p>\n
La RP-HPLC s\u00e9pare les mol\u00e9cules en fonction de leur hydrophobicit\u00e9\u00a0: plus un peptide se lie fortement \u00e0 la phase stationnaire, plus il est \u00e9lu\u00e9 tardivement. Cela fonctionne tr\u00e8s bien, mais comporte une limite structurelle. Deux variants peptidiques au caract\u00e8re hydrophobe presque identique \u2014 un produit de d\u00e9samidation, par exemple, ou un peptide comportant un acide amin\u00e9 mal coupl\u00e9 lors d’une \u00e9tape de synth\u00e8se ant\u00e9rieure \u2014 peuvent co\u00e9luer et se confondre ainsi dans le m\u00eame pic chromatographique. Le chiffre de puret\u00e9 indiqu\u00e9 para\u00eet alors plus \u00e9lev\u00e9 que la composition r\u00e9elle de l’\u00e9chantillon.<\/p>\n
En chimie analytique, ce probl\u00e8me est connu comme le risque d’une m\u00e9thode non orthogonale\u00a0: si le second contr\u00f4le s\u00e9pare selon le m\u00eame principe physique que le premier, les m\u00eames impuret\u00e9s passent inaper\u00e7ues. L’orthogonalit\u00e9 signifie qu’une seconde technique s\u00e9pare selon un principe fondamentalement diff\u00e9rent, de sorte que les impuret\u00e9s que la premi\u00e8re m\u00e9thode manque sont tout de m\u00eame mises en \u00e9vidence.<\/p>\n
La CE s\u00e9pare les mol\u00e9cules en fonction de leur mobilit\u00e9 \u00e9lectrophor\u00e9tique dans un champ \u00e9lectrique, \u00e0 l’int\u00e9rieur d’un fin capillaire de silice rempli de tampon. Cette mobilit\u00e9 d\u00e9pend du rapport charge\/masse du peptide, et non de son hydrophobicit\u00e9. Une d\u00e9samidation qui convertit une cha\u00eene lat\u00e9rale amide en acide carboxylique ne modifie pratiquement pas la r\u00e9tention en RP-HPLC, mais d\u00e9place de fa\u00e7on mesurable la charge nette du peptide \u2014 et avec elle le temps de migration en CE.<\/p>\n
Comme le m\u00e9canisme de s\u00e9paration diff\u00e8re tant de la chromatographie, l’\u00e9lectrophor\u00e8se capillaire de zone (CZE) fonctionne comme une technique orthogonale classique \u00e0 c\u00f4t\u00e9 de la RP-HPLC. L\u00e0 o\u00f9 la chromatographie demande \u00ab\u00a0\u00e0 quel point cette mol\u00e9cule est-elle grasse ou hydrophobe\u00a0\u00bb, la CE demande \u00ab\u00a0quelle charge cette mol\u00e9cule porte-t-elle et \u00e0 quelle vitesse migre-t-elle\u00a0\u00bb. Les impuret\u00e9s qui correspondent par hasard au produit principal dans ces deux dimensions sont rares, ce qui rend la combinaison des deux m\u00e9thodes particuli\u00e8rement puissante.<\/p>\n
Dans la recherche analytique publi\u00e9e, l’\u00e9lectrophor\u00e8se capillaire a \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9e \u00e0 plusieurs reprises pour d\u00e9tecter des impuret\u00e9s que la RP-HPLC seule n’avait pas rep\u00e9r\u00e9es, pr\u00e9cis\u00e9ment dans des peptides qui affichaient d\u00e9j\u00e0 un chiffre de puret\u00e9 HPLC \u00e9lev\u00e9 apr\u00e8s purification pr\u00e9parative. Les cas typiques sont\u00a0:<\/p>\n
La CE n’est donc pas un remplacement de la RP-HPLC, mais un contr\u00f4le compl\u00e9mentaire qui couvre pr\u00e9cis\u00e9ment les points faibles de la chromatographie \u2014 particuli\u00e8rement pertinent juste apr\u00e8s une \u00e9tape de purification pr\u00e9parative, lorsqu’un lot re\u00e7oit sa documentation d\u00e9finitive.<\/p>\n
L’analyse CE des peptides requiert un certain nombre de choix sp\u00e9cifiques. La composition et le pH du tampon d\u00e9terminent dans une large mesure la charge nette et donc la s\u00e9paration\u00a0: \u00e0 un pH \u00e9loign\u00e9 du point iso\u00e9lectrique du peptide, la charge est maximale et la r\u00e9solution est alors souvent la meilleure. Les capillaires en silice fondue de faible volume interne limitent l’\u00e9largissement des bandes, et la d\u00e9tection UV \u00e0 200\u2013220 nm (o\u00f9 absorbe la liaison peptidique) est le mode de lecture habituel. Pour confirmer l’identit\u00e9 en plus de la puret\u00e9, la CE peut \u00e9galement \u00eatre coupl\u00e9e \u00e0 la spectrom\u00e9trie de masse (CE-MS), qui combine s\u00e9paration et d\u00e9termination de masse dans un m\u00eame flux de travail.<\/p>\n
Comme les temps de migration en CE sont plus sensibles que les temps de r\u00e9tention en HPLC aux petites variations de tampon, de temp\u00e9rature et d’\u00e9tat du capillaire, une validation de la m\u00e9thode avec des \u00e9talons de r\u00e9f\u00e9rence appropri\u00e9s est indispensable avant d’int\u00e9grer des donn\u00e9es CE \u00e0 c\u00f4t\u00e9 des donn\u00e9es HPLC dans un rapport analytique.<\/p>\n
Pour un groupe de recherche qui synth\u00e9tise et purifie ses propres lots, l’ajout d’une technique orthogonale comme la CE est une \u00e9tape logique apr\u00e8s la cha\u00eene de purification compos\u00e9e du clivage, de l’HPLC pr\u00e9parative et du regroupement des fractions. Le chiffre figurant sur un certificat d’analyse n’est jamais plus solide que la m\u00e9thode par laquelle il a \u00e9t\u00e9 d\u00e9termin\u00e9\u00a0; la combinaison de deux principes de s\u00e9paration fondamentalement diff\u00e9rents donne une image bien plus robuste de la composition r\u00e9elle d’un \u00e9chantillon de recherche.<\/p>\n
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