{"id":872,"date":"2026-08-01T00:00:00","date_gmt":"2026-07-31T22:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/?p=872"},"modified":"2026-10-14T21:04:23","modified_gmt":"2026-10-14T19:04:23","slug":"hplc-chromatogram","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/blogs\/leren-over-peptiden\/hplc-chromatogram","title":{"rendered":"Chromatogramme HPLC\u00a0: explication et exemples d\u00e9taill\u00e9s pour les \u00e9tudiants"},"content":{"rendered":"<\/p>\n<p>Un chromatogramme HPLC est une repr\u00e9sentation graphique de la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur (axe des ordonn\u00e9es, exprim\u00e9e en mAU en d\u00e9tection UV) en fonction du temps d&rsquo;\u00e9lution ou de r\u00e9tention (axe des abscisses, en minutes). Un seul chromatogramme fournit directement trois types d&rsquo;informations\u00a0: l&rsquo;identification d&rsquo;un analyte par son temps de r\u00e9tention (tR), la quantification par l&rsquo;aire du pic associ\u00e9e \u00e0 une droite d&rsquo;\u00e9talonnage, et le contr\u00f4le du syst\u00e8me \u00e0 l&rsquo;aide de param\u00e8tres tels que la r\u00e9solution (Rs), le nombre de plateaux th\u00e9oriques (N) et la stabilit\u00e9 de la ligne de base. Les syst\u00e8mes de Waters, Thermo Fisher Scientific et Shimadzu produisent tous le m\u00eame type de graphique, mais les logiciels de traitement des donn\u00e9es associ\u00e9s (Empower, Chromeleon et LabSolutions) diff\u00e8rent dans la mani\u00e8re dont les pics sont int\u00e9gr\u00e9s et rapport\u00e9s.<\/p>\n<p>Les trois points \u00e0 v\u00e9rifier dans la premi\u00e8re minute\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>\n<strong>Stabilit\u00e9 de la ligne de base<\/strong>\u00a0: une ligne de base plate et peu bruit\u00e9e est la condition pr\u00e9alable \u00e0 une int\u00e9gration fiable.<\/li>\n<li>\n<strong>Temps de r\u00e9tention par rapport \u00e0 une r\u00e9f\u00e9rence<\/strong>\u00a0: comparez le tR de chaque pic \u00e0 celui d&rsquo;un \u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence sur le m\u00eame syst\u00e8me.<\/li>\n<li>\n<strong>Aire du pic ou hauteur du pic<\/strong>\u00a0: utilisez toujours l&rsquo;aire du pic pour la quantification, et non la hauteur du pic.<\/li>\n<\/ul>\n<p><strong>Conseil pratique\u00a0:<\/strong> <em>V\u00e9rifiez l&rsquo;aire du pic avant la hauteur du pic et confirmez chaque identification \u00e0 l&rsquo;aide d&rsquo;un \u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence certifi\u00e9. La hauteur du pic est plus sensible aux variations de largeur de pic dues \u00e0 des modifications de colonne ou de d\u00e9bit\u00a0; l&rsquo;aire du pic reste plus stable.<\/em><\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"inhoudsopgave\" tabindex=\"-1\">Sommaire<\/h2>\n<ul>\n<li><a href=\"#wat-toont-de-anatomie-van-een-hplc-chromatogram\">Que montre l&rsquo;anatomie d&rsquo;un chromatogramme HPLC\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#welke-formules-gebruik-je-voor-chromatografische-parameters\">Quelles formules utiliser pour les param\u00e8tres chromatographiques\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#hoe-ga-je-van-piekoppervlak-naar-concentratie\">Comment passer de l&rsquo;aire du pic \u00e0 la concentration\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#hoe-beinvloedt-de-detector-het-chromatogram\">Quelle est l&rsquo;influence du d\u00e9tecteur sur le chromatogramme\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#isocratisch-of-gradient-wat-zie-je-in-het-chromatogram\">Isocratique ou gradient\u00a0: que voit-on sur le chromatogramme\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#hoe-interpreteer-je-een-chromatogram-stap-voor-stap\">Comment interpr\u00e9ter un chromatogramme \u00e9tape par \u00e9tape\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#welke-problemen-zijn-zichtbaar-in-een-chromatogram-en-hoe-los-je-ze-op\">Quels probl\u00e8mes sont visibles sur un chromatogramme et comment les r\u00e9soudre\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#twee-uitgewerkte-voorbeelden-met-volledige-berekeningen\">Deux exemples d\u00e9taill\u00e9s avec calculs complets<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#wat-zijn-de-kernverschillen-tussen-hplc-en-gc\">Quelles sont les principales diff\u00e9rences entre HPLC et CPG\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#hoe-extraheer-je-retentietijden-en-piekoppervlakken-uit-een-chromatogram\">Comment extraire les temps de r\u00e9tention et les aires de pic d&rsquo;un chromatogramme\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#stap-voor-stap-kwantificatie-met-een-kalibratiecurve\">Quantification \u00e9tape par \u00e9tape \u00e0 l&rsquo;aide d&rsquo;une courbe d&rsquo;\u00e9talonnage<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#hoe-herken-en-onderscheid-je-overlappende-pieken\">Comment reconna\u00eetre et distinguer des pics qui se chevauchent\u00a0?<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#belangrijkste-inzichten\">Points essentiels<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#wat-studenten-en-junior-wetenschappers-vaak-onderschatten\">Ce que les \u00e9tudiants et les jeunes chercheurs sous-estiment souvent<\/a><\/li>\n<li><a href=\"#aanbevolen-bronnen-voor-verder-lezen\">Lectures recommand\u00e9es<\/a><\/li>\n<\/ul>\n<h2 id=\"wat-toont-de-anatomie-van-een-hplc-chromatogram\" tabindex=\"-1\">Que montre l&rsquo;anatomie d&rsquo;un chromatogramme HPLC\u00a0?<\/h2>\n<p>L&rsquo;axe des abscisses indique le temps de r\u00e9tention en minutes, parfois exprim\u00e9 en volume d&rsquo;\u00e9lution (mL). L&rsquo;axe des ordonn\u00e9es repr\u00e9sente la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur\u00a0: en milli-unit\u00e9s d&rsquo;absorbance (mAU) en d\u00e9tection UV, en courant ionique en spectrom\u00e9trie de masse, en unit\u00e9s d&rsquo;indice de r\u00e9fraction en r\u00e9fractom\u00e9trie. La r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur en mAU est l&rsquo;unit\u00e9 la plus utilis\u00e9e dans les laboratoires de routine.<\/p>\n<p>Termes cl\u00e9s que vous retrouvez sur chaque trac\u00e9\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>\n<strong>t0 \/ tM<\/strong>\u00a0: temps mort, le temps n\u00e9cessaire \u00e0 une substance non retenue pour traverser la colonne.<\/li>\n<li>\n<strong>tR<\/strong>\u00a0: temps de r\u00e9tention, mesur\u00e9 de l&rsquo;injection jusqu&rsquo;au maximum du pic.<\/li>\n<li>\n<strong>tR&rsquo;<\/strong>\u00a0: temps de r\u00e9tention net, calcul\u00e9 comme tR \u2212 tM\u00a0; il repr\u00e9sente l&rsquo;interaction effective avec la phase stationnaire.<\/li>\n<li>\n<strong>Aire du pic<\/strong>\u00a0: l&rsquo;int\u00e9grale sous la courbe du pic\u00a0; une mesure directe de la quantit\u00e9 d&rsquo;analyte.<\/li>\n<li>\n<strong>Hauteur du pic<\/strong>\u00a0: la r\u00e9ponse maximale du d\u00e9tecteur pour un pic\u00a0; utile pour une comparaison rapide, mais moins robuste pour la quantification.<\/li>\n<li>\n<strong>Facteur de tra\u00een\u00e9e (Tf)<\/strong>\u00a0: une mesure de la forme du pic\u00a0; la valeur id\u00e9ale est Tf = 1,0, une valeur de 0,8 \u00e0 1,5 est acceptable.<\/li>\n<\/ul>\n<p>La ligne de base est la ligne qui repr\u00e9sente la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur en l&rsquo;absence d&rsquo;analytes. Le bruit est la fluctuation al\u00e9atoire autour de cette ligne de base. Un rapport signal\/bruit (S\/N) d&rsquo;au moins 3 correspond \u00e0 la limite de d\u00e9tection (LOD)\u00a0; un S\/N de 10 \u00e0 la limite de quantification (LOQ). Une d\u00e9rive de la ligne de base, visible sous la forme d&rsquo;une ligne qui monte ou descend progressivement, indique une instabilit\u00e9 thermique du d\u00e9tecteur, un \u00e9quilibrage insuffisant de la colonne ou une composition changeante de la phase mobile.<\/p>\n<p>Des logiciels tels qu&rsquo;Empower (Waters) ou Chromeleon (Thermo Fisher Scientific) int\u00e8grent automatiquement les pics en tra\u00e7ant une ligne de base du d\u00e9but \u00e0 la fin d&rsquo;un pic et en calculant l&rsquo;aire comprise entre les deux. Une inspection visuelle avant le rapport final reste n\u00e9cessaire\u00a0: l&rsquo;int\u00e9gration automatique ne d\u00e9tecte pas toujours une ligne de base oblique ou int\u00e8gre parfois des pics qui se chevauchent comme un seul.<\/p>\n<p><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/csuxjmfbwmkxiegfpljm.supabase.co\/storage\/v1\/object\/public\/blog-images\/organization-48623\/1785606957756_Hands-operating-HPLC-instrument-control-panel.jpeg\" alt=\"Deux mains manipulant le panneau de commande d'un instrument HPLC.\"><\/p>\n<hr>\n<p><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/csuxjmfbwmkxiegfpljm.supabase.co\/storage\/v1\/object\/public\/blog-images\/organization-48623\/1785606967408_Vertical-infographic-of-HPLC-chromatogram-key-steps.jpeg\" alt=\"Infographie verticale : les principales \u00e9tapes d'un chromatogramme HPLC pr\u00e9sent\u00e9es clairement\"><\/p>\n<h2 id=\"welke-formules-gebruik-je-voor-chromatografische-parameters\" tabindex=\"-1\">Quelles formules utiliser pour les param\u00e8tres chromatographiques\u00a0?<\/h2>\n<p>Les cinq param\u00e8tres qui sous-tendent l&rsquo;interpr\u00e9tation analytique et le contr\u00f4le du syst\u00e8me, avec leurs formules\u00a0:<\/p>\n<p><strong>Temps de r\u00e9tention net<\/strong><br \/>\ntR&rsquo; = tR \u2212 tM<\/p>\n<p><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/csuxjmfbwmkxiegfpljm.supabase.co\/storage\/v1\/object\/public\/blog-images\/organization-48623\/1785606962205_Scientist-calculating-chromatographic-parameters-at-desk.jpeg\" alt=\"Un chercheur \u00e0 son bureau, concentr\u00e9 sur le calcul de param\u00e8tres chromatographiques.\"><\/p>\n<p><strong>Facteur de capacit\u00e9 (k)<\/strong><br \/>\nk = tR&rsquo; \/ tM = (tR \u2212 tM) \/ tM<\/p>\n<p>En pratique, une valeur de k comprise entre 1 et 10 est souhaitable\u00a0; en dehors de cette plage, la s\u00e9paration est soit trop rapide, soit trop lente.<\/p>\n<p><strong>S\u00e9lectivit\u00e9 (\u03b1)<\/strong><br \/>\n\u03b1 = k\u2082 \/ k\u2081 (avec k\u2082 &gt; k\u2081)<\/p>\n<p>\u03b1 &gt; 1 signifie que deux substances peuvent \u00eatre distingu\u00e9es\u00a0; plus \u03b1 est \u00e9lev\u00e9, meilleure est la s\u00e9lectivit\u00e9.<\/p>\n<p><strong>Plateaux th\u00e9oriques (N)<\/strong><br \/>\nN = 16 \u00d7 (tR \/ w)\u00b2 o\u00f9 w est la largeur du pic \u00e0 la base<br \/>\nou\u00a0: N = 5,54 \u00d7 (tR \/ w\u2080.\u2085)\u00b2 o\u00f9 w\u2080.\u2085 est la largeur \u00e0 mi-hauteur<\/p>\n<p>Un N plus \u00e9lev\u00e9 indique une meilleure efficacit\u00e9 de la colonne. Les valeurs typiques pour une colonne C18 de 150 mm se situent entre 5\u202f000 et 20\u202f000 plateaux th\u00e9oriques.<\/p>\n<p><strong>R\u00e9solution (Rs)<\/strong><br \/>\nRs = 2 \u00d7 (tR2 \u2212 tR1) \/ (w1 + w2)<\/p>\n<p>Rs \u2265 1,5 est la norme pour une s\u00e9paration \u00e0 la ligne de base dans les m\u00e9thodes quantitatives\u00a0; Rs = 1,0 donne un chevauchement d&rsquo;environ 4\u00a0%.<\/p>\n<p><strong>Facteur de tra\u00een\u00e9e (Tf)<\/strong><br \/>\nTf = (b \/ a) o\u00f9 a est la distance entre le maximum du pic et le front montant et b la distance jusqu&rsquo;au front descendant, mesur\u00e9es \u00e0 5\u00a0% de la hauteur du pic.<\/p>\n<h3 id=\"gewerkt-voorbeeld-n-en-rs-berekenen\" tabindex=\"-1\">Exemple d\u00e9taill\u00e9\u00a0: calcul de N et de Rs<\/h3>\n<p>Supposons deux pics voisins pr\u00e9sentant les valeurs suivantes\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>Pic 1\u00a0: tR1 = 5,00 min, w1 = 0,40 min<\/li>\n<li>Pic 2\u00a0: tR2 = 5,60 min, w2 = 0,44 min<\/li>\n<li>tM = 0,80 min<\/li>\n<\/ul>\n<p><strong>\u00c9tape 1 \u2014 N pour le pic 1\u00a0:<\/strong><br \/>\nN = 16 \u00d7 (5,00 \/ 0,40)\u00b2 = 16 \u00d7 156,25 = <strong>2\u202f500 plateaux th\u00e9oriques<\/strong><\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 2 \u2014 Rs\u00a0:<\/strong><br \/>\nRs = 2 \u00d7 (5,60 \u2212 5,00) \/ (0,40 + 0,44) = 2 \u00d7 0,60 \/ 0,84 = <strong>1,43<\/strong><\/p>\n<p>Rs = 1,43 se situe juste en dessous de la limite id\u00e9ale de 1,5. Pour la quantification, une optimisation de la m\u00e9thode est conseill\u00e9e\u00a0: augmenter la longueur de la colonne, r\u00e9duire le d\u00e9bit ou ajuster la composition de la phase mobile.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"hoe-ga-je-van-piekoppervlak-naar-concentratie\" tabindex=\"-1\">Comment passer de l&rsquo;aire du pic \u00e0 la concentration\u00a0?<\/h2>\n<p>L&rsquo;aire du pic est une mesure directe de la quantit\u00e9 d&rsquo;analyte qui passe devant le d\u00e9tecteur. Un facteur 10 de diff\u00e9rence dans l&rsquo;aire du pic correspond \u00e0 un facteur 10 de diff\u00e9rence de concentration, \u00e0 condition que la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur soit lin\u00e9aire dans le domaine de travail. La hauteur du pic est plus sensible aux variations de largeur de pic et convient donc moins \u00e0 une quantification pr\u00e9cise \u2014 une erreur fr\u00e9quente chez les \u00e9tudiants, qui assimilent directement un pic plus haut \u00e0 une concentration plus \u00e9lev\u00e9e.<\/p>\n<h3 id=\"stap-1-correcte-integratie\" tabindex=\"-1\">\u00c9tape 1\u00a0: une int\u00e9gration correcte<\/h3>\n<p>Fixez manuellement les limites de la ligne de base si le logiciel trace une ligne de base incorrecte. Filtrez le bruit avec une constante de temps adapt\u00e9e, mais \u00e9vitez un filtrage excessif, qui \u00e9largit artificiellement le pic.<\/p>\n<h3 id=\"stap-2-kalibratielijn-met-externe-standaarden\" tabindex=\"-1\">\u00c9tape 2\u00a0: droite d&rsquo;\u00e9talonnage avec des \u00e9talons externes<\/h3>\n<p>Pr\u00e9parez au moins quatre solutions \u00e9talons de concentrations connues. Mesurez l&rsquo;aire du pic de chaque \u00e9talon dans des conditions identiques.<\/p>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>\u00c9talon<\/th>\n<th>Concentration (\u00b5g\/mL)<\/th>\n<th>Aire du pic (mAU\u00b7s)<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>S1<\/td>\n<td>\u2014<\/td>\n<td>2\u202f500<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S2<\/td>\n<td>1,0<\/td>\n<td>2\u202f490<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S3<\/td>\n<td>2,0<\/td>\n<td>4\u202f985<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S4<\/td>\n<td>5,00<\/td>\n<td>12\u202f455<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<h3 id=\"stap-3-lineaire-regressie-en-monsterberekening\" tabindex=\"-1\">\u00c9tape 3\u00a0: r\u00e9gression lin\u00e9aire et calcul pour l&rsquo;\u00e9chantillon<\/h3>\n<p>Effectuez une r\u00e9gression lin\u00e9aire\u00a0: Aire = a \u00d7 Concentration + b. Avec les donn\u00e9es ci-dessus, on obtient approximativement\u00a0:<\/p>\n<p>a \u2248 2\u202f490 mAU\u00b7s par \u00b5g\/mL, b \u2248 5 mAU\u00b7s (une ordonn\u00e9e \u00e0 l&rsquo;origine quasiment nulle, ce qui confirme une bonne lin\u00e9arit\u00e9).<\/p>\n<p>Un \u00e9chantillon dont l&rsquo;aire de pic mesur\u00e9e est de 6\u202f200 mAU\u00b7s donne\u00a0:<\/p>\n<p>Concentration = (6\u202f200 \u2212 5) \/ 2\u202f490 \u2248 <strong>2,49 \u00b5g\/mL<\/strong><\/p>\n<p>La LOD et la LOQ sont d\u00e9termin\u00e9es conceptuellement \u00e0 partir du rapport signal\/bruit\u00a0: LOD \u00e0 S\/N = 3, LOQ \u00e0 S\/N = 10. Pour la validation des m\u00e9thodes quantitatives, l&rsquo;ICH Q2(R1) renvoie \u00e0 des crit\u00e8res suppl\u00e9mentaires de lin\u00e9arit\u00e9, d&rsquo;exactitude et de pr\u00e9cision.<\/p>\n<p><strong>Attention<\/strong>\u00a0: la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur diff\u00e8re d&rsquo;un analyte \u00e0 l&rsquo;autre. Un d\u00e9tecteur UV \u00e0 254 nm ne r\u00e9pond pas aux substances d\u00e9pourvues de structure aromatique ou conjugu\u00e9e. Utilisez toujours un \u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence de la substance \u00e0 quantifier, ou un \u00e9talon interne de structure comparable, pour d\u00e9terminer correctement les facteurs de r\u00e9ponse.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"hoe-beinvloedt-de-detector-het-chromatogram\" tabindex=\"-1\">Quelle est l&rsquo;influence du d\u00e9tecteur sur le chromatogramme\u00a0?<\/h2>\n<p>Le choix du d\u00e9tecteur d\u00e9termine quels analytes sont visibles, quelle est la sensibilit\u00e9 de la mesure et comment l&rsquo;axe des ordonn\u00e9es doit \u00eatre interpr\u00e9t\u00e9.<\/p>\n<ul>\n<li>\n<strong>D\u00e9tecteur UV\/Vis<\/strong>\u00a0: mesure l&rsquo;absorption \u00e0 une longueur d&rsquo;onde fixe\u00a0; exprime le r\u00e9sultat en mAU. Convient aux compos\u00e9s aromatiques, aux peptides (214 nm pour la bande peptidique) et \u00e0 la plupart des substances pharmaceutiques. Simple et robuste.<\/li>\n<li>\n<strong>PDA (d\u00e9tecteur \u00e0 barrette de diodes)<\/strong>\u00a0: enregistre un spectre UV complet \u00e0 chaque point dans le temps. Utile pour l&rsquo;identification spectrale et le contr\u00f4le de la puret\u00e9 des pics\u00a0: un pic dont le spectre n&rsquo;est pas homog\u00e8ne sur toute sa forme indique une co-\u00e9lution.<\/li>\n<li>\n<strong>MS (spectrom\u00e8tre de masse, LC-MS)<\/strong>\u00a0: fournit une information de masse pour chaque pic, ce qui permet une confirmation structurale. Indispensable pour l&rsquo;analyse de traces et les compos\u00e9s inconnus. Les modes d&rsquo;ionisation tels que l&rsquo;ESI (ionisation par \u00e9lectron\u00e9bulisation) ou l&rsquo;APCI d\u00e9terminent quels compos\u00e9s s&rsquo;ionisent.<\/li>\n<li>\n<strong>RI (d\u00e9tecteur d&rsquo;indice de r\u00e9fraction)<\/strong>\u00a0: mesure la variation de l&rsquo;indice de r\u00e9fraction\u00a0; convient aux analytes non absorbants tels que les sucres, les polym\u00e8res et les lipides. Sensible aux fluctuations de temp\u00e9rature et inutilisable en \u00e9lution par gradient.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Conseils pratiques par d\u00e9tecteur\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>En UV\/Vis, choisissez la longueur d&rsquo;onde correspondant au maximum d&rsquo;absorption de l&rsquo;analyte pour une sensibilit\u00e9 maximale\u00a0; 220 nm offre une large couverture, mais un bruit de fond plus \u00e9lev\u00e9.<\/li>\n<li>Laissez le d\u00e9tecteur RI se stabiliser pendant au moins 30 \u00e0 60 minutes avant utilisation\u00a0; m\u00eame de faibles variations de temp\u00e9rature provoquent une d\u00e9rive de la ligne de base.<\/li>\n<li>En LC-MS, v\u00e9rifiez les param\u00e8tres d&rsquo;ionisation (tension du capillaire, temp\u00e9rature) pour chaque classe d&rsquo;analytes\u00a0; un mauvais r\u00e9glage supprime enti\u00e8rement le signal.<\/li>\n<\/ul>\n<p><strong>Conseil pratique\u00a0:<\/strong> <em>Lors d&rsquo;une quantification, v\u00e9rifiez toujours que la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur est lin\u00e9aire dans la plage de concentrations \u00e9tudi\u00e9e. Un R\u00b2 de la droite d&rsquo;\u00e9talonnage inf\u00e9rieur \u00e0 0,995 signale que le domaine lin\u00e9aire est d\u00e9pass\u00e9 ou que la mesure est perturb\u00e9e.<\/em><\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"isocratisch-of-gradient-wat-zie-je-in-het-chromatogram\" tabindex=\"-1\">Isocratique ou gradient\u00a0: que voit-on sur le chromatogramme\u00a0?<\/h2>\n<p>En <strong>\u00e9lution isocratique<\/strong>, la composition de la phase mobile reste constante tout au long de l&rsquo;analyse. Les temps de r\u00e9tention sont reproductibles et la m\u00e9thode est facile \u00e0 valider. Les pics des composants \u00e9lu\u00e9s t\u00f4t sont \u00e9troits et fins\u00a0; les composants \u00e9lu\u00e9s plus tard s&rsquo;\u00e9largissent par diffusion longitudinale.<\/p>\n<p>En <strong>\u00e9lution par gradient<\/strong>, le rapport entre les composants de la phase mobile (eau\/ac\u00e9tonitrile, par exemple) varie progressivement au cours de l&rsquo;analyse. Les pics \u00e9lu\u00e9s plus tard sont comprim\u00e9s\u00a0: ils sont plus fins qu&rsquo;en conditions isocratiques, ce qui augmente la sensibilit\u00e9. L&rsquo;\u00e9lution par gradient est indispensable pour les \u00e9chantillons dont les composants couvrent une large gamme de polarit\u00e9s, comme les extraits biologiques ou les m\u00e9langes de peptides.<\/p>\n<p>Diff\u00e9rences visibles sur le chromatogramme\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>\n<strong>Isocratique<\/strong>\u00a0: stabilit\u00e9 r\u00e9guli\u00e8re de la ligne de base, largeur de pic croissante aux temps de r\u00e9tention plus longs, absorption de fond stable.<\/li>\n<li>\n<strong>Gradient<\/strong>\u00a0: ligne de base montante ou descendante en raison de la variation de l&rsquo;absorption UV de la phase mobile (absorption du solvant), pics comprim\u00e9s pour les composants \u00e9lu\u00e9s tardivement, et phase de r\u00e9\u00e9quilibrage en fin d&rsquo;analyse.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Choisissez le mode isocratique pour des \u00e9chantillons simples dont les composants ont une polarit\u00e9 comparable et lorsque la validation de la m\u00e9thode exige de la simplicit\u00e9. Choisissez le gradient lorsque les temps de r\u00e9tention des composants sont trop \u00e9loign\u00e9s pour une seule condition isocratique, ou lorsque les pics tardifs deviennent trop larges pour une int\u00e9gration fiable.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"hoe-interpreteer-je-een-chromatogram-stap-voor-stap\" tabindex=\"-1\">Comment interpr\u00e9ter un chromatogramme \u00e9tape par \u00e9tape\u00a0?<\/h2>\n<p>Une approche structur\u00e9e \u00e9vite que des erreurs dans les donn\u00e9es ne soient d\u00e9couvertes tardivement. La liste de contr\u00f4le suivante constitue un protocole minimal pour chaque analyse.<\/p>\n<ol>\n<li>\n<strong>V\u00e9rifiez la ligne de base et le bruit<\/strong>\u00a0: la ligne de base est-elle plate et stable avant le premier pic\u00a0? Un bruit sup\u00e9rieur \u00e0 0,5 mAU en d\u00e9tection UV justifie une investigation (d\u00e9gazage, remplacement du filtre).<\/li>\n<li>\n<strong>Comparez les temps de r\u00e9tention \u00e0 l&rsquo;\u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence<\/strong>\u00a0: le tR de chaque analyte ne doit pas s&rsquo;\u00e9carter de plus de \u00b10,1 min de la r\u00e9f\u00e9rence sur le m\u00eame syst\u00e8me, dans les m\u00eames conditions.<\/li>\n<li>\n<strong>\u00c9valuez la forme des pics<\/strong>\u00a0: facteur de tra\u00een\u00e9e entre 0,8 et 1,5\u00a0; un Tf &gt; 2,0 indique une d\u00e9gradation de la colonne ou une forte adsorption sur des sites actifs.<\/li>\n<li>\n<strong>V\u00e9rifiez les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration<\/strong>\u00a0: les limites de la ligne de base sont-elles correctement plac\u00e9es\u00a0? Les pics qui se chevauchent sont-ils correctement s\u00e9par\u00e9s ou int\u00e9gr\u00e9s comme un seul\u00a0?<\/li>\n<li>\n<strong>Calculez Rs pour les paires critiques<\/strong>\u00a0: Rs \u2265 1,5 pour les m\u00e9thodes quantitatives\u00a0; Rs &lt; 1,0 impose un ajustement de la m\u00e9thode.<\/li>\n<li>\n<strong>V\u00e9rifiez l&rsquo;\u00e9talon interne ou le taux de r\u00e9cup\u00e9ration<\/strong>\u00a0: le rapport d&rsquo;aires de pic de l&rsquo;\u00e9talon interne ne doit pas varier de plus de \u00b12\u00a0% entre les injections.<\/li>\n<\/ol>\n<h3 id=\"systeem-suitability-acceptatiecriteria\" tabindex=\"-1\">Crit\u00e8res d&rsquo;acceptation de la conformit\u00e9 du syst\u00e8me<\/h3>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>Param\u00e8tre<\/th>\n<th>Limite d&rsquo;acceptation typique<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>Plateaux th\u00e9oriques (N)<\/td>\n<td>\u2265 2\u202f000 (selon la m\u00e9thode)<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>R\u00e9solution (Rs)<\/td>\n<td>\u2265 1,5 pour les paires critiques<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Facteur de tra\u00een\u00e9e (Tf)<\/td>\n<td>0,8\u20131,5<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>RSD de l&rsquo;aire du pic (n=6)<\/td>\n<td>\u2264 1,0\u00a0% pour les m\u00e9thodes quantitatives<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>RSD du temps de r\u00e9tention (n=6)<\/td>\n<td>\u2264 0,5\u00a0%<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<p>Lorsqu&rsquo;un ou plusieurs param\u00e8tres sortent des limites d&rsquo;acceptation, ne r\u00e9p\u00e9tez pas l&rsquo;analyse sans avoir d&rsquo;abord identifi\u00e9 la cause. Une analyse r\u00e9p\u00e9t\u00e9e avec le m\u00eame d\u00e9faut du syst\u00e8me ne fournit aucune donn\u00e9e exploitable.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"welke-problemen-zijn-zichtbaar-in-een-chromatogram-en-hoe-los-je-ze-op\" tabindex=\"-1\">Quels probl\u00e8mes sont visibles sur un chromatogramme et comment les r\u00e9soudre\u00a0?<\/h2>\n<p>Les artefacts d&rsquo;un chromatogramme sont des signaux diagnostiques, pas le fruit du hasard. Chaque motif renvoie \u00e0 une cause pr\u00e9cise.<\/p>\n<ul>\n<li>\n<strong>D\u00e9rive de la ligne de base<\/strong>\u00a0: les causes sont un \u00e9quilibrage insuffisant de la colonne, des fluctuations de temp\u00e9rature ou une composition changeante de la phase mobile. Solution\u00a0: \u00e9quilibrez la colonne avec au moins 10 volumes de colonne, v\u00e9rifiez la temp\u00e9rature du four \u00e0 colonne et utilisez une phase mobile fra\u00eechement pr\u00e9par\u00e9e.<\/li>\n<li>\n<strong>Bruit \u00e9lev\u00e9<\/strong>\u00a0: bulles d&rsquo;air dans le d\u00e9tecteur ou la phase mobile, cellule de mesure contamin\u00e9e ou lampe d\u00e9fectueuse. D\u00e9gazez la phase mobile \u00e0 l&rsquo;h\u00e9lium ou sous vide, nettoyez la cellule de mesure, remplacez la lampe au deut\u00e9rium des d\u00e9tecteurs UV.<\/li>\n<li>\n<strong>Pics fant\u00f4mes<\/strong>\u00a0: pics sans analyte correspondant, dus \u00e0 des impuret\u00e9s de la phase mobile, \u00e0 un effet m\u00e9moire d&rsquo;une injection pr\u00e9c\u00e9dente ou \u00e0 une contamination du syst\u00e8me d&rsquo;injection. Rincez le syst\u00e8me avec un solvant fort et v\u00e9rifiez la proc\u00e9dure de lavage de l&rsquo;aiguille.<\/li>\n<li>\n<strong>Co-\u00e9lution<\/strong>\u00a0: deux analytes sont \u00e9lu\u00e9s sous la forme d&rsquo;un seul pic large ou asym\u00e9trique. Augmentez Rs en allongeant la colonne, en ajustant le gradient ou en choisissant une autre phase stationnaire. La d\u00e9tection PDA aide \u00e0 d\u00e9tecter une co-\u00e9lution gr\u00e2ce \u00e0 l&rsquo;h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 spectrale sur la forme du pic.<\/li>\n<li>\n<strong>Pics d\u00e9doubl\u00e9s<\/strong>\u00a0: un pic pr\u00e9sentant deux maxima, d\u00fb \u00e0 un vide en t\u00eate de colonne, \u00e0 une mauvaise dissolution de l&rsquo;\u00e9chantillon ou \u00e0 un solvant d&rsquo;\u00e9chantillon trop fort. V\u00e9rifiez la t\u00eate de colonne, dissolvez l&rsquo;\u00e9chantillon dans la phase mobile et r\u00e9duisez le volume d&rsquo;injection.<\/li>\n<li>\n<strong>Pics larges<\/strong>\u00a0: d\u00e9bit trop \u00e9lev\u00e9, volume d&rsquo;injection trop important ou d\u00e9gradation de la colonne. R\u00e9duisez le d\u00e9bit, diminuez le volume d&rsquo;injection ou remplacez la colonne.<\/li>\n<\/ul>\n<p><strong>Conseil pratique\u00a0:<\/strong> <em>Documentez syst\u00e9matiquement chaque modification\u00a0: date, lot de phase mobile, identifiant de la colonne et nombre d&rsquo;injections effectu\u00e9es sur la colonne. Les artefacts r\u00e9currents peuvent presque toujours \u00eatre rattach\u00e9s \u00e0 un lot pr\u00e9cis ou \u00e0 une colonne arriv\u00e9e en fin de vie.<\/em><\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"twee-uitgewerkte-voorbeelden-met-volledige-berekeningen\" tabindex=\"-1\">Deux exemples d\u00e9taill\u00e9s avec calculs complets<\/h2>\n<h3 id=\"voorbeeld-a-identificatie-via-retentietijd\" tabindex=\"-1\">Exemple A\u00a0: identification par le temps de r\u00e9tention<\/h3>\n<p>Valeurs donn\u00e9es pour une analyse de peptide\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>tM = 0,80 min (mesur\u00e9 avec un marqueur non retenu, l&rsquo;uracile par exemple)<\/li>\n<li>tR de l&rsquo;\u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence (<a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/products\/ghk-cu\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">GHK-Cu<\/a>, par exemple)\u00a0: 6,40 min<\/li>\n<li>tR de l&rsquo;\u00e9chantillon\u00a0: 6,38 min<\/li>\n<\/ul>\n<p>Calcul du temps de r\u00e9tention net\u00a0:<br \/>\ntR&rsquo; (r\u00e9f\u00e9rence) = 6,40 \u2212 0,80 = <strong>5,60 min<\/strong><br \/>\ntR&rsquo; (\u00e9chantillon) = 6,38 \u2212 0,80 = <strong>5,58 min<\/strong><\/p>\n<p>L&rsquo;\u00e9cart de 0,02 min (1,2 seconde) se situe dans la limite d&rsquo;acceptation de \u00b10,1 min. Le pic de l&rsquo;\u00e9chantillon est provisoirement identifi\u00e9 comme la substance cible. Une confirmation d\u00e9finitive n\u00e9cessite une deuxi\u00e8me m\u00e9thode orthogonale ou une confirmation par MS.<\/p>\n<h3 id=\"voorbeeld-b-kwantificatie-via-externe-standaard\" tabindex=\"-1\">Exemple B\u00a0: quantification par \u00e9talon externe<\/h3>\n<p>Utilisez les donn\u00e9es d&rsquo;\u00e9talonnage de la section 4 (a = 2\u202f490 mAU\u00b7s par \u00b5g\/mL, b = 5 mAU\u00b7s).<\/p>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>\u00c9talon<\/th>\n<th>Concentration (\u00b5g\/mL)<\/th>\n<th>Aire mesur\u00e9e (mAU\u00b7s)<\/th>\n<th>Aire calcul\u00e9e (mAU\u00b7s)<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>S1<\/td>\n<td>\u2014<\/td>\n<td>2\u202f500<\/td>\n<td>2\u202f500<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S2<\/td>\n<td>1,0<\/td>\n<td>2\u202f490<\/td>\n<td>2\u202f490<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S3<\/td>\n<td>2,0<\/td>\n<td>4\u202f985<\/td>\n<td>4\u202f985<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>S4<\/td>\n<td>5,00<\/td>\n<td>12\u202f455<\/td>\n<td>12\u202f455<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>\u00c9chantillon<\/td>\n<td>inconnue<\/td>\n<td>6\u202f200<\/td>\n<td>\u2014<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<p>Concentration de l&rsquo;\u00e9chantillon = (6\u202f200 \u2212 5) \/ 2\u202f490 = <strong>2,49 \u00b5g\/mL<\/strong><\/p>\n<p>La lin\u00e9arit\u00e9 (R\u00b2 \u2248 0,9999) confirme que la m\u00e9thode convient \u00e0 la quantification dans ce domaine. Conservez avec chaque rapport les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration, l&rsquo;identification de la colonne et les num\u00e9ros de lot des \u00e9talons\u00a0: la reproductibilit\u00e9 ne peut \u00eatre d\u00e9montr\u00e9e que si les conditions sont enti\u00e8rement document\u00e9es.<\/p>\n<p><strong>Conseil pratique\u00a0:<\/strong> <em>Enregistrez les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration sous forme de fichier de m\u00e9thode dans le logiciel de traitement des donn\u00e9es (Empower, Chromeleon ou LabSolutions). Les ajustements manuels \u00e0 chaque analyse sont une source de variabilit\u00e9 et rendent la comparaison entre analyses peu fiable.<\/em><\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"wat-zijn-de-kernverschillen-tussen-hplc-en-gc\" tabindex=\"-1\">Quelles sont les principales diff\u00e9rences entre HPLC et CPG\u00a0?<\/h2>\n<p>Les deux techniques produisent un chromatogramme avec le temps de r\u00e9tention en abscisse et la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur en ordonn\u00e9e, mais leurs domaines d&rsquo;application et leurs exigences diff\u00e8rent sensiblement.<\/p>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>Caract\u00e9ristique<\/th>\n<th>HPLC<\/th>\n<th>CPG<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>\u00c9tat physique de l&rsquo;\u00e9chantillon<\/td>\n<td>Liquide ou dissous dans un solvant<\/td>\n<td>Volatil ou vaporisable<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Stabilit\u00e9 thermique requise<\/td>\n<td>Non<\/td>\n<td>Oui (plage de temp\u00e9rature selon la m\u00e9thode)<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>D\u00e9tecteurs typiques<\/td>\n<td>UV\/Vis, PDA, MS, RI<\/td>\n<td>FID, TCD, MS, ECD<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Analytes adapt\u00e9s<\/td>\n<td>Mol\u00e9cules polaires, ioniques, de grande taille (peptides, prot\u00e9ines, sucres)<\/td>\n<td>Petites mol\u00e9cules volatiles et thermiquement stables<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Phase mobile<\/td>\n<td>Solvant liquide (eau\/ac\u00e9tonitrile, eau\/m\u00e9thanol)<\/td>\n<td>Gaz vecteur inerte (h\u00e9lium, azote)<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<p>Une r\u00e8gle empirique pratique\u00a0: choisissez l&rsquo;HPLC pour les compos\u00e9s non volatils, thermolabiles ou polaires tels que les peptides, les acides amin\u00e9s et les principes actifs pharmaceutiques. La CPG est la m\u00e9thode de choix pour les compos\u00e9s organiques volatils, les solvants r\u00e9siduels et les gaz.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"hoe-extraheer-je-retentietijden-en-piekoppervlakken-uit-een-chromatogram\" tabindex=\"-1\">Comment extraire les temps de r\u00e9tention et les aires de pic d&rsquo;un chromatogramme\u00a0?<\/h2>\n<p>Extraire des donn\u00e9es quantitatives d&rsquo;un chromatogramme est une comp\u00e9tence qui exige de la pr\u00e9cision, et pas seulement la connaissance du logiciel.<\/p>\n<p><strong>D\u00e9termination du temps de r\u00e9tention<\/strong>\u00a0: zoomez sur le maximum du pic dans le logiciel de traitement des donn\u00e9es. Relevez la valeur de tR au maximum exact, et non sur le flanc. Pour les pics asym\u00e9triques, le maximum peut sembler d\u00e9cal\u00e9 visuellement\u00a0; utilisez la valeur que le logiciel calcule \u00e0 partir de la d\u00e9riv\u00e9e seconde.<\/p>\n<p><strong>Extraction de l&rsquo;aire du pic<\/strong>\u00a0: v\u00e9rifiez d&rsquo;abord les limites de ligne de base plac\u00e9es par le logiciel. Une ligne de base qui commence trop t\u00f4t ou trop tard entra\u00eene une surestimation ou une sous-estimation de l&rsquo;aire. Pour des pics qui se chevauchent, choisissez soit une s\u00e9paration par perpendiculaire (une ligne verticale au creux de la vall\u00e9e), soit une m\u00e9thode tangentielle, selon le degr\u00e9 de chevauchement et les sp\u00e9cifications de la m\u00e9thode.<\/p>\n<p>\u00c9tapes pratiques dans le logiciel de traitement des donn\u00e9es\u00a0:<\/p>\n<ul>\n<li>Ouvrez le chromatogramme en mode int\u00e9gration (par exemple \u00ab\u00a0Integration Events\u00a0\u00bb dans Empower ou \u00ab\u00a0Peak Integration\u00a0\u00bb dans LabSolutions de Shimadzu).<\/li>\n<li>R\u00e9glez la largeur de pic minimale et le seuil de fa\u00e7on \u00e0 supprimer le bruit sans manquer de vrais pics.<\/li>\n<li>Exportez le tableau d&rsquo;int\u00e9gration avec tR, aire du pic, hauteur du pic et facteur de tra\u00een\u00e9e vers un tableur pour les calculs ult\u00e9rieurs.<\/li>\n<li>Comparez les valeurs de tR extraites \u00e0 l&rsquo;\u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence sur le m\u00eame syst\u00e8me\u00a0; un \u00e9cart sup\u00e9rieur \u00e0 \u00b10,1 min impose une v\u00e9rification.<\/li>\n<\/ul>\n<hr>\n<h2 id=\"stap-voor-stap-kwantificatie-met-een-kalibratiecurve\" tabindex=\"-1\">Quantification \u00e9tape par \u00e9tape \u00e0 l&rsquo;aide d&rsquo;une courbe d&rsquo;\u00e9talonnage<\/h2>\n<p>Une proc\u00e9dure de quantification compl\u00e8te comporte cinq \u00e9tapes r\u00e9alis\u00e9es dans un ordre fixe.<\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 1 \u2014 Pr\u00e9parer les solutions \u00e9talons<\/strong>\u00a0: pr\u00e9parez au moins quatre niveaux de concentration couvrant la plage de concentrations attendue pour l&rsquo;\u00e9chantillon. Utilisez des \u00e9talons de r\u00e9f\u00e9rence certifi\u00e9s de puret\u00e9 connue\u00a0; pour les peptides, des CoA sp\u00e9cifiques au lot fournis par le fournisseur sont n\u00e9cessaires.<\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 2 \u2014 Mesurer les \u00e9talons<\/strong>\u00a0: injectez chaque \u00e9talon au moins deux fois dans des conditions identiques (colonne, phase mobile, d\u00e9bit, temp\u00e9rature, volume d&rsquo;injection). Calculez l&rsquo;aire de pic moyenne pour chaque niveau de concentration.<\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 3 \u2014 \u00c9tablir la droite d&rsquo;\u00e9talonnage<\/strong>\u00a0: tracez la concentration (x) en fonction de l&rsquo;aire de pic moyenne (y). Effectuez une r\u00e9gression lin\u00e9aire. N&rsquo;acceptez la droite que si R\u00b2 \u2265 0,999 pour les m\u00e9thodes pharmaceutiques quantitatives, ou au minimum R\u00b2 \u2265 0,995 conform\u00e9ment aux principes de l&rsquo;ICH Q2(R1).<\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 4 \u2014 Mesurer l&rsquo;\u00e9chantillon<\/strong>\u00a0: injectez l&rsquo;\u00e9chantillon exactement dans les m\u00eames conditions que les \u00e9talons. Relevez l&rsquo;aire du pic.<\/p>\n<p><strong>\u00c9tape 5 \u2014 Calculer la concentration<\/strong>\u00a0: utilisez l&rsquo;\u00e9quation de r\u00e9gression\u00a0:<\/p>\n<p>Concentration (\u00b5g\/mL) = (Aire mesur\u00e9e \u2212 b) \/ a<\/p>\n<p>o\u00f9 a est la pente et b l&rsquo;ordonn\u00e9e \u00e0 l&rsquo;origine de la droite d&rsquo;\u00e9talonnage.<\/p>\n<p>V\u00e9rifiez que la concentration calcul\u00e9e se situe dans le domaine \u00e9talonn\u00e9. Si la valeur se situe en dehors de ce domaine, diluez l&rsquo;\u00e9chantillon et r\u00e9p\u00e9tez la mesure.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"hoe-herken-en-onderscheid-je-overlappende-pieken\" tabindex=\"-1\">Comment reconna\u00eetre et distinguer des pics qui se chevauchent\u00a0?<\/h2>\n<p>Les pics qui se chevauchent sont l&rsquo;une des difficult\u00e9s les plus fr\u00e9quentes en analyse HPLC. On les reconna\u00eet \u00e0 un pic large et asym\u00e9trique pr\u00e9sentant un \u00e9paulement ou une vall\u00e9e entre deux maxima, ou \u00e0 un pic dont le spectre (en d\u00e9tection PDA) n&rsquo;est pas homog\u00e8ne sur toute la forme du pic.<\/p>\n<p><strong>M\u00e9thodes pour distinguer des pics qui se chevauchent<\/strong>\u00a0:<\/p>\n<p><strong>Am\u00e9liorer la s\u00e9paration chromatographique<\/strong>\u00a0: augmentez Rs en allongeant la colonne, en r\u00e9duisant la taille des particules de la phase stationnaire (par exemple de 5 \u00b5m \u00e0 des particules sub-2 \u00b5m de 1,8 \u00b5m pour l&rsquo;UHPLC), en optimisant le gradient ou en choisissant une autre phase stationnaire (par exemple de C18 \u00e0 C8 ou ph\u00e9nyle).<\/p>\n<p><strong>D\u00e9convolution par le logiciel de traitement des donn\u00e9es<\/strong>\u00a0: des m\u00e9thodes d&rsquo;int\u00e9gration avanc\u00e9es telles que l&rsquo;ajustement EMG (Exponentially Modified Gaussian, gaussienne modifi\u00e9e exponentiellement) mod\u00e9lisent math\u00e9matiquement la forme du pic et s\u00e9parent les contributions qui se chevauchent. Des logiciels tels que Chromeleon (Thermo Fisher Scientific) et Empower (Waters) proposent des options de d\u00e9convolution. La m\u00e9thode fonctionne le mieux lorsque les pics sont partiellement s\u00e9par\u00e9s (Rs entre 0,5 et 1,0) et que les formes de pic sont connues.<\/p>\n<p><strong>D\u00e9convolution spectrale PDA<\/strong>\u00a0: lorsque deux substances qui se chevauchent ont des spectres UV diff\u00e9rents, la d\u00e9tection PDA permet de s\u00e9parer les contributions par longueur d&rsquo;onde. Il ne s&rsquo;agit pas d&rsquo;une s\u00e9paration chromatographique compl\u00e8te, mais elle fournit une information quantitative pour chaque composant.<\/p>\n<p><strong>Ajouter un \u00e9talon interne<\/strong>\u00a0: un \u00e9talon interne dont le temps de r\u00e9tention connu est proche des pics qui se chevauchent aide \u00e0 calibrer la limite d&rsquo;int\u00e9gration et \u00e0 corriger les erreurs syst\u00e9matiques.<\/p>\n<p>En cas de chevauchement important (Rs &lt; 0,5), l&rsquo;optimisation chromatographique de la m\u00e9thode est la seule solution fiable. La d\u00e9convolution introduit une incertitude d\u00e9pendante du mod\u00e8le, qui limite l&rsquo;exactitude de la quantification.<\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"belangrijkste-inzichten\" tabindex=\"-1\">Points essentiels<\/h2>\n<p>Un chromatogramme HPLC fournit en une seule mesure l&rsquo;identification, la quantification et le contr\u00f4le du syst\u00e8me, \u00e0 condition que la ligne de base soit stable, que l&rsquo;int\u00e9gration soit correctement param\u00e9tr\u00e9e et que les temps de r\u00e9tention soient compar\u00e9s \u00e0 des \u00e9talons de r\u00e9f\u00e9rence certifi\u00e9s.<\/p>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>Point<\/th>\n<th>D\u00e9tails<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>Identification par le temps de r\u00e9tention<\/td>\n<td>Comparez toujours le tR de l&rsquo;\u00e9chantillon \u00e0 un \u00e9talon de r\u00e9f\u00e9rence sur le m\u00eame syst\u00e8me\u00a0; un \u00e9cart \u2264 0,1 min est acceptable.<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Quantification par l&rsquo;aire du pic<\/td>\n<td>Utilisez l&rsquo;aire du pic, et non sa hauteur, et \u00e9tablissez une droite d&rsquo;\u00e9talonnage avec au moins quatre \u00e9talons (R\u00b2 \u2265 0,999).<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>V\u00e9rifier la conformit\u00e9 du syst\u00e8me<\/td>\n<td>Contr\u00f4lez N, Rs (\u2265 1,5), le facteur de tra\u00een\u00e9e (0,8\u20131,5) et la RSD de l&rsquo;aire du pic (\u2264 1,0\u00a0%) avant tout rapport.<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Conserver la documentation<\/td>\n<td>Enregistrez pour chaque analyse les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration, l&rsquo;identifiant de la colonne, les num\u00e9ros de lot et les CoA, pour la reproductibilit\u00e9 et le d\u00e9pannage.<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Traiter les pics qui se chevauchent<\/td>\n<td>Am\u00e9liorez Rs par voie chromatographique ou appliquez une d\u00e9convolution EMG\u00a0; \u00e0 Rs &lt; 0,5, une optimisation de la m\u00e9thode est n\u00e9cessaire.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<hr>\n<h2 id=\"wat-studenten-en-junior-wetenschappers-vaak-onderschatten\" tabindex=\"-1\">Ce que les \u00e9tudiants et les jeunes chercheurs sous-estiment souvent<\/h2>\n<p>L&rsquo;aspect technique de l&rsquo;interpr\u00e9tation HPLC s&rsquo;apprend dans les manuels et les tutoriels. Ce qui re\u00e7oit moins d&rsquo;attention, c&rsquo;est la rigueur de la documentation et l&rsquo;int\u00e9r\u00eat de ne faire varier d\u00e9lib\u00e9r\u00e9ment qu&rsquo;un seul param\u00e8tre \u00e0 la fois.<\/p>\n<p>Une erreur fr\u00e9quente\u00a0: r\u00e9p\u00e9ter une analyse sans comprendre la cause d&rsquo;un \u00e9cart. Si le facteur de tra\u00een\u00e9e passe soudain \u00e0 2,3 alors qu&rsquo;il \u00e9tait de 1,1 la veille, il est inutile de r\u00e9p\u00e9ter tant que la cause n&rsquo;a pas \u00e9t\u00e9 \u00e9tablie. Une documentation syst\u00e9matique, incluant l&rsquo;\u00e2ge de la colonne, le lot de phase mobile et l&rsquo;historique des injections, rend ce type de diagnostic possible.<\/p>\n<p>Comme supports d&rsquo;apprentissage, nous recommandons les guides d&rsquo;introduction \u00e0 l&rsquo;HPLC de Waters et les tutoriels de Thermo Fisher Scientific, tous deux librement accessibles et contenant des exemples de chromatogrammes comment\u00e9s. Shimadzu propose des explications pratiques sur les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration dans sa documentation LabSolutions. Pour les notions de validation (LOD, LOQ, lin\u00e9arit\u00e9, pr\u00e9cision), l&rsquo;ICH Q2(R1) est la r\u00e9f\u00e9rence principale.<\/p>\n<p>Entra\u00eenez-vous avec les outils d&rsquo;int\u00e9gration num\u00e9rique en int\u00e9grant plusieurs fois le m\u00eame jeu de donn\u00e9es avec des param\u00e8tres diff\u00e9rents et en comparant les r\u00e9sultats. Comparez vos propres analyses \u00e0 des chromatogrammes de r\u00e9f\u00e9rence publi\u00e9s pour les m\u00eames compos\u00e9s. Tenez un cahier de laboratoire qui consigne non seulement les r\u00e9sultats, mais aussi les d\u00e9cisions\u00a0: pourquoi la ligne de base a-t-elle \u00e9t\u00e9 trac\u00e9e ici, pourquoi ce pic a-t-il \u00e9t\u00e9 int\u00e9gr\u00e9 comme un seul composant\u00a0?<\/p>\n<p><strong>Conseil pratique\u00a0:<\/strong> <em>Lors de l&rsquo;optimisation d&rsquo;une m\u00e9thode, ne modifiez jamais qu&rsquo;un seul param\u00e8tre \u00e0 la fois. Deux modifications simultan\u00e9es emp\u00eachent de distinguer la cause de l&rsquo;effet.<\/em><\/p>\n<hr>\n<h2 id=\"aanbevolen-bronnen-voor-verder-lezen\" tabindex=\"-1\">Lectures recommand\u00e9es<\/h2>\n<ul>\n<li>\n<strong><a href=\"https:\/\/www.waters.com\/nextgen\/us\/en\/education\/primers\/beginner-s-guide-to-liquid-chromatography\/identifying-and-quantitating-compounds.html\" rel=\"nofollow noopener noreferrer\" target=\"_blank\">Guide d&rsquo;introduction \u00e0 l&rsquo;HPLC de Waters<\/a><\/strong>\u00a0: explication pratique de l&rsquo;identification et de la quantification, avec des exemples d\u00e9taill\u00e9s de calculs d&rsquo;aire de pic et d&rsquo;\u00e9talonnage\u00a0; accessible aux \u00e9tudiants et aux laboratoires de routine.<\/li>\n<li>\n<strong>Tutoriels Chromeleon de Thermo Fisher Scientific<\/strong>\u00a0: explication \u00e9tape par \u00e9tape des param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration, de la conformit\u00e9 du syst\u00e8me et des syst\u00e8mes de donn\u00e9es\u00a0; disponibles sur le site web de Thermo Fisher Scientific.<\/li>\n<li>\n<strong>Documentation Shimadzu LabSolutions<\/strong>\u00a0: manuels pratiques sur les param\u00e8tres d&rsquo;int\u00e9gration et l&rsquo;interpr\u00e9tation des chromatogrammes\u00a0; utiles pour les utilisateurs de syst\u00e8mes Shimadzu.<\/li>\n<li>\n<strong><a href=\"https:\/\/nl.wikipedia.org\/wiki\/Retentietijd_(chromatografie)\" rel=\"nofollow noopener noreferrer\" target=\"_blank\">Temps de r\u00e9tention (chromatographie) \u2014 Wikip\u00e9dia<\/a><\/strong>\u00a0: une d\u00e9finition concise en n\u00e9erlandais de tR, tM et tR&rsquo;, avec les formules\u00a0; utile comme aide-m\u00e9moire.<\/li>\n<li>\n<strong>ICH Q2(R1) \u2014 Validation of Analytical Procedures<\/strong>\u00a0: la principale ligne directrice internationale pour la validation des m\u00e9thodes quantitatives, avec les crit\u00e8res de lin\u00e9arit\u00e9, LOD, LOQ, exactitude et pr\u00e9cision. Disponible sur le site web de l&rsquo;ICH (ich.org).<\/li>\n<li>\n<strong>UHPLCs \u2014 How to read HPLC data<\/strong>\u00a0: une explication pratique en n\u00e9erlandais de l&rsquo;interpr\u00e9tation des chromatogrammes, du contr\u00f4le de la ligne de base et de l&rsquo;int\u00e9gration.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Dutchpeptidelabs fournit avec chaque produit un CoA sp\u00e9cifique au lot, fond\u00e9 sur des analyses HPLC ind\u00e9pendantes. Les <a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/labresultaten\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">r\u00e9sultats de laboratoire<\/a> sont accessibles publiquement et pr\u00e9sentent, pour chaque lot, les chromatogrammes de puret\u00e9 et les donn\u00e9es d&rsquo;int\u00e9gration. Pour les chercheurs qui souhaitent comprendre le contr\u00f4le qualit\u00e9 de peptides tels que <a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/products\/kpv\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">KPV<\/a>, ces CoA offrent un exemple concret de l&rsquo;application pratique de la quantification par HPLC.<\/p>\n<p><em>Cet article fournit des informations scientifiques g\u00e9n\u00e9rales sur l&rsquo;analyse HPLC. Pour la validation de m\u00e9thodes et les applications r\u00e9glementaires, consultez les lignes directrices applicables (ICH Q2(R1)) et un chimiste analyste qualifi\u00e9.<\/em><\/p>\n<h2 id=\"aanbeveling\" tabindex=\"-1\">Recommand\u00e9<\/h2>\n<ul>\n<li><a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/products\/kpv\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Acheter le peptide KPV &#8211; Dutch Peptide Labs<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr?post_type=product&#038;p=302\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Acheter KLOW Blend | Dutch Peptide Labs<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/products\/glow-blend\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Acheter GLOW Blend | Dutch Peptide Labs<\/a><\/li>\n<li><a href=\"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/products\/alcoholdoekjes\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Acheter des lingettes alcoolis\u00e9es | Dutch Peptide Labs<\/a><\/li>\n<\/ul>\n<p><a href=\"https:\/\/www.babylovegrowth.ai\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Article g\u00e9n\u00e9r\u00e9 par BabyLoveGrowth<\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Un chromatogramme HPLC est une repr\u00e9sentation graphique de la r\u00e9ponse du d\u00e9tecteur (axe des ordonn\u00e9es, exprim\u00e9e en mAU en d\u00e9tection UV) en fonction du temps d&rsquo;\u00e9lution ou de r\u00e9tention (axe des abscisses, en minutes). Un seul chromatogramme fournit directement trois types d&rsquo;informations\u00a0: l&rsquo;identification d&rsquo;un analyte par son temps de r\u00e9tention (tR), la quantification par l&rsquo;aire [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":408,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[243],"tags":[],"class_list":["post-872","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-uncategorized-fr"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/872","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=872"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/872\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81829,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/872\/revisions\/81829"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/media\/408"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=872"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=872"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=872"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}