La synth\u00e8se peptidique en phase solide (SPPS) est la m\u00e9thode de r\u00e9f\u00e9rence pour construire des peptides de recherche, r\u00e9sidu par r\u00e9sidu, sur un support de r\u00e9sine solide. Des articles pr\u00e9c\u00e9dents de ce blog ont pr\u00e9sent\u00e9 les \u00e9l\u00e9ments de ce processus\u00a0: groupements protecteurs, choix de la r\u00e9sine, r\u00e9actifs de couplage et clivage qui lib\u00e8re le peptide brut de la r\u00e9sine. Ce qui reste implicite dans cette cha\u00eene, c’est que la SPPS a une limite de longueur pratique. \u00c0 mesure que la cha\u00eene s’allonge, les couplages incomplets, les s\u00e9quences de d\u00e9l\u00e9tion et l’agr\u00e9gation sur r\u00e9sine de la cha\u00eene peptidique en croissance s’accumulent. Au-del\u00e0 d’environ 50 acides amin\u00e9s, la probabilit\u00e9 d’obtenir un produit final homog\u00e8ne devient statistiquement de plus en plus faible, m\u00eame avec un protocole optimis\u00e9.<\/p>\n
Pour la recherche sur des peptides de recherche plus longs et de petites prot\u00e9ines, c’est un v\u00e9ritable goulot d’\u00e9tranglement. La solution d\u00e9velopp\u00e9e dans la litt\u00e9rature n’est pas une synth\u00e8se plus longue, mais l’assemblage chimique de plusieurs fragments plus courts, chacun obtenu par SPPS. La technique la plus utilis\u00e9e \u00e0 cette fin est la ligation chimique native (NCL).<\/p>\n
La NCL, d\u00e9crite \u00e0 l’origine par le groupe de recherche de Stephen Kent dans les ann\u00e9es 1990, fait intervenir deux fragments peptidiques non prot\u00e9g\u00e9s qui r\u00e9agissent l’un avec l’autre de mani\u00e8re chimios\u00e9lective, en tampon aqueux \u00e0 pH neutre. L’un des fragments porte un thioester \u00e0 son extr\u00e9mit\u00e9 C-terminale, l’autre poss\u00e8de une cyst\u00e9ine libre \u00e0 son extr\u00e9mit\u00e9 N-terminale. Comme les deux fragments sont enti\u00e8rement non prot\u00e9g\u00e9s, aucune \u00e9tape de d\u00e9protection distincte n’est n\u00e9cessaire apr\u00e8s la ligation proprement dite, ce qui simplifie consid\u00e9rablement le proc\u00e9d\u00e9 par rapport \u00e0 la condensation de fragments classique.<\/p>\n
La r\u00e9action se d\u00e9roule en deux \u00e9tapes. Il se produit d’abord une transthioest\u00e9rification\u00a0: le groupement thiol de la cyst\u00e9ine attaque le thioester et forme un nouvel interm\u00e9diaire thioester temporaire au site de ligation. Cet interm\u00e9diaire subit ensuite un transfert d’acyle intramol\u00e9culaire S\u2192N, au cours duquel le groupement acyle migre du soufre vers le groupement amine de la m\u00eame cyst\u00e9ine. Le r\u00e9sultat est une liaison amide native \u2014 chimiquement indiscernable d’une liaison peptidique form\u00e9e lors d’un couplage SPPS ordinaire.<\/p>\n
Chaque fragment est assembl\u00e9 et purifi\u00e9 s\u00e9par\u00e9ment par Fmoc-SPPS standard, exactement comme d\u00e9crit pr\u00e9c\u00e9demment sur ce blog pour des peptides plus courts. Le fragment C-terminal est converti en thioester pendant ou apr\u00e8s la synth\u00e8se, tandis que le fragment N-terminal du segment suivant n\u00e9cessite une cyst\u00e9ine en premi\u00e8re position. Pour des travaux de recherche qui d\u00e9passent ce que deux fragments peuvent couvrir \u2014 des prot\u00e9ines cibles d’environ cent \u00e0 deux cent cinquante acides amin\u00e9s \u2014, plusieurs ligations sont r\u00e9alis\u00e9es l’une apr\u00e8s l’autre (de mani\u00e8re s\u00e9quentielle) ou \u00e0 partir d’un fragment central (de mani\u00e8re convergente). Cela exige un ordre strict des \u00e9tapes de d\u00e9protection et de ligation, car chaque fragment ne peut agir qu’une seule fois comme partenaire r\u00e9actif avant que le couplage suivant n’intervienne.<\/p>\n
La principale limite pratique de la NCL classique est la n\u00e9cessit\u00e9 d’une cyst\u00e9ine \u00e0 chaque site de ligation. Toutes les s\u00e9quences de recherche ne comportent pas naturellement une cyst\u00e9ine \u00e0 cet endroit, et l’introduction d’une cyst\u00e9ine suppl\u00e9mentaire peut modifier les propri\u00e9t\u00e9s de l’objet d’\u00e9tude. La litt\u00e9rature d\u00e9crit donc des groupements auxiliaires thiol\u00e9s amovibles et des acides amin\u00e9s modifi\u00e9s qui imitent la r\u00e9activit\u00e9 de la cyst\u00e9ine et peuvent \u00eatre retir\u00e9s apr\u00e8s la ligation, de sorte que la s\u00e9quence d’origine est pr\u00e9serv\u00e9e.<\/p>\n
Les conditions r\u00e9actionnelles sont tout aussi critiques. Le tampon de ligation est g\u00e9n\u00e9ralement maintenu \u00e0 pH 7 et contient un catalyseur thiol\u00e9, tel que le MPAA, qui acc\u00e9l\u00e8re l’\u00e9change de thioester et emp\u00eache l’interm\u00e9diaire de stagner. L’oxyg\u00e8ne est exclu autant que possible, car les groupements thiol libres s’oxyderaient sinon en ponts disulfure ind\u00e9sirables, ce qui r\u00e9duirait le rendement de ligation. Une fois la ligation termin\u00e9e, une \u00e9tape de purification suppl\u00e9mentaire par RP-HPLC pr\u00e9parative suit g\u00e9n\u00e9ralement, afin de s\u00e9parer le fragment n’ayant pas r\u00e9agi du produit de ligation.<\/p>\n
La ligation chimique native a ouvert, en chimie des peptides, l’acc\u00e8s \u00e0 un mat\u00e9riel de recherche inaccessible par SPPS classique\u00a0: des cha\u00eenes synth\u00e9tiques plus longues, voire de petites prot\u00e9ines enti\u00e8rement synth\u00e9tiques, construites \u00e0 partir de segments pouvant chacun \u00eatre bien contr\u00f4l\u00e9s et purifi\u00e9s s\u00e9par\u00e9ment. Pour les laboratoires qui travaillent avec des constructions de ce type, cela implique un niveau de planification suppl\u00e9mentaire \u2014 quels fragments, quels sites de ligation, quel ordre \u2014 en plus de la synth\u00e8se et de la purification d\u00e9j\u00e0 n\u00e9cessaires pour chaque fragment.<\/p>\n
Ces informations sont exclusivement destin\u00e9es \u00e0 des fins de laboratoire et de recherche. Les produits et les informations de Dutch Peptide Labs ne sont pas destin\u00e9s \u00e0 \u00eatre utilis\u00e9s chez l’\u00eatre humain ou l’animal, ni \u00e0 des applications diagnostiques ou th\u00e9rapeutiques.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Pourquoi la SPPS ne se prolonge pas ind\u00e9finiment La synth\u00e8se peptidique en phase solide (SPPS) est la m\u00e9thode de r\u00e9f\u00e9rence pour construire des peptides de recherche, r\u00e9sidu par r\u00e9sidu, sur un support de r\u00e9sine solide. Des articles pr\u00e9c\u00e9dents de ce blog ont pr\u00e9sent\u00e9 les \u00e9l\u00e9ments de ce processus\u00a0: groupements protecteurs, choix de la r\u00e9sine, r\u00e9actifs […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[243],"tags":[],"class_list":["post-882","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-fr"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/882","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=882"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/882\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81843,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/882\/revisions\/81843"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=882"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=882"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=882"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}