Une d\u00e9termination de la masse intacte par LC-MS confirme qu’un peptide de recherche pr\u00e9sente la bonne masse mol\u00e9culaire, mais en dit peu sur l’ordre exact des acides amin\u00e9s qui le composent. Deux peptides de masse identique peuvent avoir des s\u00e9quences enti\u00e8rement diff\u00e9rentes \u00e0 la suite d’une permutation de r\u00e9sidus. La cartographie peptidique est la technique qui permet pr\u00e9cis\u00e9ment de faire cette distinction\u00a0: elle d\u00e9coupe un peptide en fragments plus petits, faciles \u00e0 analyser, et \u00e9tablit ainsi la s\u00e9quence compl\u00e8te. Pour le contr\u00f4le qualit\u00e9 des peptides de recherche, elle constitue un compl\u00e9ment pr\u00e9cieux aux analyses de masse intacte et de puret\u00e9.<\/p>\n
Un spectrom\u00e8tre de masse mesure la masse mol\u00e9culaire d’un peptide intact avec une grande pr\u00e9cision et, combin\u00e9e au temps de r\u00e9tention en RP-HPLC, elle fournit une forte indication de l’identit\u00e9. Il existe n\u00e9anmoins des cas o\u00f9 cela n’offre pas une certitude suffisante\u00a0: des substitutions isobares d’acides amin\u00e9s (comme la leucine et l’isoleucine, qui ont exactement la m\u00eame masse), des permutations entre deux r\u00e9sidus qui, ensemble, donnent la m\u00eame masse qu’une autre paire, ou une d\u00e9l\u00e9tion qui se trouve compens\u00e9e par une autre d\u00e9viation. Dans ces cas, la masse intacte ne r\u00e9v\u00e8le aucune erreur de s\u00e9quence, alors que l’ordre r\u00e9el des acides amin\u00e9s diff\u00e8re de la s\u00e9quence pr\u00e9vue. La cartographie peptidique a \u00e9t\u00e9 d\u00e9velopp\u00e9e pour d\u00e9tecter pr\u00e9cis\u00e9ment ce type de d\u00e9viation cach\u00e9e, en examinant le peptide au niveau de sa s\u00e9quence plut\u00f4t que comme un tout.<\/p>\n
La premi\u00e8re \u00e9tape de la cartographie peptidique consiste \u00e0 fragmenter le peptide de recherche \u00e0 des sites pr\u00e9visibles. La digestion enzymatique par des prot\u00e9ases telles que la trypsine (qui clive apr\u00e8s la lysine et l’arginine) ou la Glu-C (qui clive apr\u00e8s l’acide glutamique) est l’approche la plus r\u00e9pandue, car ces enzymes coupent de mani\u00e8re tr\u00e8s sp\u00e9cifique et reproductible. Pour les peptides qui ne contiennent pas de sites appropri\u00e9s pour la trypsine ou la Glu-C, ou pour une \u00e9lucidation structurale cibl\u00e9e, on a parfois recours \u00e0 une digestion chimique, comme le clivage au bromure de cyanog\u00e8ne (CNBr) au niveau des r\u00e9sidus de m\u00e9thionine. Le choix de la m\u00e9thode de digestion d\u00e9pend fortement de la composition en acides amin\u00e9s du peptide de recherche concern\u00e9\u00a0: une s\u00e9quence d\u00e9pourvue de lysine ou d’arginine exige une autre enzyme ou une voie chimique, contrairement \u00e0 un peptide riche en lysine.<\/p>\n
Apr\u00e8s la digestion, le m\u00e9lange de fragments est s\u00e9par\u00e9 par HPLC en phase inverse coupl\u00e9e \u00e0 la spectrom\u00e9trie de masse en tandem (LC-MS\/MS). Chaque fragment est d’abord pes\u00e9 (MS1), puis fragment\u00e9 \u00e0 nouveau dans l’instrument (MS2), les fragments de collision obtenus r\u00e9v\u00e9lant l’ordre des acides amin\u00e9s au sein de ce morceau de peptide. En comparant les masses de fragments mesur\u00e9es aux fragments th\u00e9oriquement attendus de la s\u00e9quence pr\u00e9vue, on obtient une \u00ab\u00a0couverture de s\u00e9quence\u00a0\u00bb\u00a0: le pourcentage de la s\u00e9quence qui a effectivement \u00e9t\u00e9 confirm\u00e9 exp\u00e9rimentalement. Une couverture compl\u00e8te ou quasi compl\u00e8te offre nettement plus de certitude sur l’int\u00e9grit\u00e9 de la s\u00e9quence qu’une seule mesure de masse intacte ne peut en apporter.<\/p>\n
Dans le cadre du contr\u00f4le qualit\u00e9 des peptides de recherche, la cartographie peptidique est principalement utilis\u00e9e comme confirmation orthogonale, en compl\u00e9ment de la combinaison habituelle de la puret\u00e9 par RP-HPLC et de la spectrom\u00e9trie de masse intacte, en particulier pour les s\u00e9quences plus longues, les peptides comportant plusieurs r\u00e9sidus modifi\u00e9s, ou lorsque des analyses ant\u00e9rieures ont donn\u00e9 un r\u00e9sultat ambigu. La litt\u00e9rature m\u00e9thodologique publi\u00e9e d\u00e9crit la cartographie peptidique par digestion chimique et MALDI-MS comme une approche \u00e9tablie de confirmation de s\u00e9quence dans la caract\u00e9risation des prot\u00e9ines et des peptides, et les m\u00eames principes s’appliquent aux peptides de recherche synth\u00e9tiques. Pour la lib\u00e9ration de routine des lots, la m\u00e9thode demande plus de travail qu’une v\u00e9rification standard du CoA\u00a0; c’est pourquoi elle est plus souvent r\u00e9serv\u00e9e \u00e0 une confirmation cibl\u00e9e de l’identit\u00e9 qu’employ\u00e9e pour chaque lot produit.<\/p>\n
Une couverture de s\u00e9quence incompl\u00e8te ne signifie pas automatiquement une erreur de s\u00e9quence\u00a0: certains fragments sont trop petits ou trop hydrophiles pour \u00eatre bien retenus sur la colonne HPLC et peuvent donc \u00eatre perdus avant d’atteindre le spectrom\u00e8tre de masse. Les chercheurs qui appliquent la cartographie peptidique ou la font r\u00e9aliser en tiennent compte en adaptant la strat\u00e9gie de digestion \u00e0 la s\u00e9quence concern\u00e9e et en combinant plusieurs enzymes lorsqu’une seule enzyme donne une couverture insuffisante. On obtient ainsi une image plus compl\u00e8te et plus fiable de l’ordre r\u00e9el des acides amin\u00e9s du mat\u00e9riel de recherche.<\/p>\n
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