Apr\u00e8s l’\u00e9tape de clivage, ce n’est pas un peptide de recherche pur qui se trouve sur la paillasse, mais un m\u00e9lange brut complexe. L’article pr\u00e9c\u00e9dent de cette s\u00e9rie expliquait comment les pi\u00e9geurs utilis\u00e9s lors du clivage au TFA emp\u00eachent les carbocations r\u00e9actifs d’endommager le peptide. L’\u00e9tape suivante du processus est au moins aussi d\u00e9terminante pour la qualit\u00e9 finale\u00a0: la purification par HPLC pr\u00e9parative. Cet article d\u00e9crit comment les laboratoires de recherche transforment un m\u00e9lange de synth\u00e8se brut en une fraction peptidique d\u00e9finie et pure.<\/p>\n
Une solution de peptide brut obtenue apr\u00e8s clivage et pr\u00e9cipitation contient rarement la seule s\u00e9quence cible. Outre le peptide souhait\u00e9, le m\u00e9lange contient g\u00e9n\u00e9ralement des s\u00e9quences de d\u00e9l\u00e9tion (issues de couplages manqu\u00e9s, comme \u00e9voqu\u00e9 pr\u00e9c\u00e9demment \u00e0 propos du capping), des s\u00e9quences tronqu\u00e9es, des variants oxyd\u00e9s ou rac\u00e9mis\u00e9s, des restes de groupements protecteurs et des sous-produits des pi\u00e9geurs. Comme bon nombre de ces impuret\u00e9s ressemblent chimiquement de tr\u00e8s pr\u00e8s au peptide cible, une simple filtration ou extraction est insuffisante. La s\u00e9paration chromatographique fond\u00e9e sur de faibles diff\u00e9rences d’hydrophobie est l’approche habituelle en contexte de recherche.<\/p>\n
La purification pr\u00e9parative des peptides de recherche est r\u00e9alis\u00e9e principalement par HPLC en phase inverse sur une colonne C18. Un m\u00e9lange d’eau et d’ac\u00e9tonitrile, additionn\u00e9 d’une petite quantit\u00e9 d’acide trifluoroac\u00e9tique comme r\u00e9actif d’appariement d’ions, constitue la phase mobile. \u00c0 mesure que la proportion d’ac\u00e9tonitrile augmente dans le gradient, les peptides sont \u00e9lu\u00e9s par ordre d’hydrophobie croissante. Le peptide cible et les impuret\u00e9s \u00e9troitement apparent\u00e9es apparaissent souvent sous forme de pics adjacents qui se chevauchent partiellement, ce qui fait de la pente du gradient et de la chimie de la colonne un param\u00e8tre de recherche critique.<\/p>\n
Le d\u00e9veloppement de m\u00e9thode commence presque toujours \u00e0 l’\u00e9chelle analytique\u00a0: une petite colonne, une faible charge, des pics bien d\u00e9finis. Pour reproduire cette m\u00eame s\u00e9paration \u00e0 plus grande \u00e9chelle, les laboratoires appliquent des r\u00e8gles de transposition d’\u00e9chelle qui relient entre eux le diam\u00e8tre de la colonne, sa longueur, la charge en \u00e9chantillon et le d\u00e9bit. Selon une r\u00e8gle empirique, la charge par gramme de phase stationnaire reste \u00e0 peu pr\u00e8s constante, tandis que le d\u00e9bit augmente proportionnellement \u00e0 la section de la colonne. Si ce rapport n’est pas respect\u00e9, la r\u00e9solution se d\u00e9grade et des pics encore s\u00e9par\u00e9s \u00e0 l’\u00e9chelle analytique se chevauchent.<\/p>\n
Pendant la s\u00e9paration pr\u00e9parative, les fractions sont collect\u00e9es sur la base de la d\u00e9tection UV, g\u00e9n\u00e9ralement \u00e0 214 ou 280 nm. Chaque fraction est ensuite contr\u00f4l\u00e9e par HPLC analytique et, en contexte de recherche, souvent aussi par spectrom\u00e9trie de masse, afin de confirmer que la masse correcte est pr\u00e9sente et qu’aucune impuret\u00e9 co-\u00e9lu\u00e9e ne contamine le pic. Seules les fractions qui atteignent le seuil de puret\u00e9 d\u00e9fini au pr\u00e9alable sont regroup\u00e9es. Cette combinaison de s\u00e9paration chromatographique et de v\u00e9rification analytique explique pourquoi un certificat d’analyse de peptides de recherche est g\u00e9n\u00e9ralement \u00e9tabli au niveau du lot, comme d\u00e9crit pr\u00e9c\u00e9demment dans l’article consacr\u00e9 aux CoA sp\u00e9cifiques au lot.<\/p>\n
Les fractions regroup\u00e9es contiennent encore des quantit\u00e9s importantes d’eau, d’ac\u00e9tonitrile et de TFA. Avant que le mat\u00e9riel de recherche purifi\u00e9 ne se pr\u00eate \u00e0 la conservation, l’ac\u00e9tonitrile est g\u00e9n\u00e9ralement \u00e9limin\u00e9 sous vide, puis vient la lyophilisation \u2014 l’\u00e9tape de s\u00e9chage par cong\u00e9lation pr\u00e9sent\u00e9e dans un article pr\u00e9c\u00e9dent de cette s\u00e9rie. On obtient une poudre stable et caract\u00e9ris\u00e9e analytiquement, qui sert de point de d\u00e9part \u00e0 la suite des travaux de recherche en laboratoire.<\/p>\n
Ces produits et informations sont exclusivement destin\u00e9s \u00e0 des fins de laboratoire et de recherche. Ils ne sont pas destin\u00e9s \u00e0 la consommation humaine ou animale, ni \u00e0 un usage diagnostique ou \u00e0 une application th\u00e9rapeutique.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Apr\u00e8s l’\u00e9tape de clivage, ce n’est pas un peptide de recherche pur qui se trouve sur la paillasse, mais un m\u00e9lange brut complexe. L’article pr\u00e9c\u00e9dent de cette s\u00e9rie expliquait comment les pi\u00e9geurs utilis\u00e9s lors du clivage au TFA emp\u00eachent les carbocations r\u00e9actifs d’endommager le peptide. L’\u00e9tape suivante du processus est au moins aussi d\u00e9terminante pour […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[243],"tags":[],"class_list":["post-889","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-fr"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/889","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=889"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/889\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81852,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/889\/revisions\/81852"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=889"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=889"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/fr\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=889"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}