Apr\u00e8s la synth\u00e8se en phase solide, le clivage, la purification par HPLC pr\u00e9parative et la lyophilisation, un peptide de recherche est rarement totalement exempt des produits chimiques qui ont rendu possibles la synth\u00e8se et la purification. Outre la teneur en eau, g\u00e9n\u00e9ralement d\u00e9termin\u00e9e par titrage Karl Fischer, il subsiste des traces des solvants organiques utilis\u00e9s pendant la synth\u00e8se et le traitement. La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est la technique analytique qui permet aux laboratoires d’identifier et de quantifier ces solvants r\u00e9siduels, en compl\u00e9ment de la caract\u00e9risation habituelle par HPLC et MS.<\/p>\n
En SPPS Fmoc, le DMF (dim\u00e9thylformamide) et la NMP (N-m\u00e9thylpyrrolidone) servent de milieu r\u00e9actionnel pour le couplage, les lavages et la d\u00e9protection Fmoc. Apr\u00e8s clivage de la r\u00e9sine, le peptide brut contient souvent encore des traces de dichlorom\u00e9thane (DCM), utilis\u00e9 pour les lavages de la r\u00e9sine et dans certains protocoles de clivage, ainsi que d’acide trifluoroac\u00e9tique (TFA) provenant du cocktail de clivage lui-m\u00eame. Lors de la purification ult\u00e9rieure par HPLC pr\u00e9parative, l’ac\u00e9tonitrile (ACN) intervient comme phase mobile. Chacune de ces substances peut, en quantit\u00e9s variables, subsister apr\u00e8s l’\u00e9tape de lyophilisation si elle n’a pas \u00e9t\u00e9 enti\u00e8rement \u00e9vapor\u00e9e ou \u00e9chang\u00e9e.<\/p>\n
En chimie analytique, les solvants sont souvent class\u00e9s selon la ligne directrice ICH Q3C, qui distingue trois classes sur la base du profil toxicologique et des seuils de d\u00e9claration qui en d\u00e9coulent. Le DMF et la NMP rel\u00e8vent g\u00e9n\u00e9ralement de la classe 2, tout comme le DCM\u00a0; l’ACN est \u00e9galement consid\u00e9r\u00e9 comme un solvant de classe 2. Ce cadre a \u00e9t\u00e9 \u00e9labor\u00e9 principalement pour l’industrie pharmaceutique, mais les laboratoires qui documentent analytiquement du mat\u00e9riel de recherche utilisent souvent la m\u00eame classification comme point de r\u00e9f\u00e9rence, afin de rapporter les teneurs r\u00e9siduelles de mani\u00e8re coh\u00e9rente et de les comparer d’un lot \u00e0 l’autre. Il s’agit d’un syst\u00e8me de classification analytico-chimique \u00e0 des fins de documentation, et non d’une indication relative \u00e0 une utilisation chez l’homme ou l’animal.<\/p>\n
Pour les solvants r\u00e9siduels volatils dans un \u00e9chantillon solide lyophilis\u00e9, on choisit g\u00e9n\u00e9ralement la CPG en espace de t\u00eate. L’\u00e9chantillon est port\u00e9 \u00e0 une temp\u00e9rature fixe dans un flacon scell\u00e9, de sorte que les composants volatils se r\u00e9partissent dans la phase gazeuse au-dessus de l’\u00e9chantillon selon leur pression de vapeur. Un volume d\u00e9fini de cette phase gazeuse est ensuite inject\u00e9 automatiquement sur la colonne de CPG, o\u00f9 la s\u00e9paration s’effectue selon la volatilit\u00e9 et la polarit\u00e9. La d\u00e9tection se fait par un d\u00e9tecteur \u00e0 ionisation de flamme (FID) pour la quantification, ou par un spectrom\u00e8tre de masse (GC-MS) lorsqu’il faut identifier des pics inconnus. L’injection en espace de t\u00eate pr\u00e9sente l’avantage que les composants non volatils de la matrice, comme le peptide lui-m\u00eame, ne chargent ni la colonne ni le d\u00e9tecteur.<\/p>\n
La CPG quantitative en espace de t\u00eate n\u00e9cessite une s\u00e9rie d’\u00e9talonnage avec des concentrations connues de chaque solvant cible, g\u00e9n\u00e9ralement pr\u00e9par\u00e9e dans une matrice qui se rapproche de la r\u00e9partition \u00e0 l’\u00e9quilibre de l’\u00e9chantillon r\u00e9el. Des \u00e9talons internes corrigent les variations du volume d’injection et de l’\u00e9quilibrage de l’espace de t\u00eate. La limite de d\u00e9claration (limite de quantification) de la plupart des solvants de classe 2 est de l’ordre de quelques dizaines \u00e0 quelques centaines de ppm, bien en dessous de ce qui serait d\u00e9tectable par une simple analyse RMN. Cette sensibilit\u00e9 est pertinente, car les solvants r\u00e9siduels, m\u00eame en faibles quantit\u00e9s, peuvent affecter l’exactitude des d\u00e9terminations gravim\u00e9triques de la teneur nette en peptide et, dans certains cas, produire des signaux interf\u00e9rents dans des techniques analytiques connexes.<\/p>\n
Pour les groupes de recherche qui veulent garantir la reproductibilit\u00e9 entre exp\u00e9riences, la documentation des solvants r\u00e9siduels fait logiquement partie de l’empreinte analytique compl\u00e8te d’un lot de peptide, avec la puret\u00e9 (HPLC), l’identit\u00e9 (MS) et la teneur en eau (Karl Fischer). Les variations de solvants r\u00e9siduels d’un lot \u00e0 l’autre peuvent en effet expliquer de petites diff\u00e9rences de comportement entre des lots de peptide apparemment identiques dans des recherches ult\u00e9rieures. Un certificat d’analyse complet qui indique \u00e9galement les valeurs de solvants r\u00e9siduels donne donc aux chercheurs une image plus compl\u00e8te du mat\u00e9riel dont ils disposent.<\/p>\n
Ces produits et informations sont destin\u00e9s exclusivement \u00e0 des fins de laboratoire et de recherche, et non \u00e0 la consommation humaine ou animale, \u00e0 un usage diagnostique ni \u00e0 une application th\u00e9rapeutique.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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