L’HPLC pr\u00e9parative fournit une s\u00e9rie de fractions, chacune avec son propre profil de puret\u00e9. Mais la fraction qui sort du collecteur n’est pas encore un produit final. Entre \u00ab\u00a0pic pur\u00a0\u00bb et \u00ab\u00a0peptide de recherche document\u00e9 sous forme de poudre\u00a0\u00bb se situent deux \u00e9tapes que de nombreux textes d’introduction laissent dans l’ombre\u00a0: d\u00e9cider quelles fractions peuvent \u00eatre regroup\u00e9es, et \u00e9changer ou \u00e9liminer le contre-ion h\u00e9rit\u00e9 de la synth\u00e8se peptidique. Cet article traite de ces deux \u00e9tapes comme de la suite logique du processus de purification.<\/p>\n
Apr\u00e8s chaque cycle de purification, chaque fraction est analys\u00e9e s\u00e9par\u00e9ment, g\u00e9n\u00e9ralement par HPLC analytique et spectrom\u00e9trie de masse. Seules les fractions qui satisfont \u00e0 un crit\u00e8re de puret\u00e9 pr\u00e9d\u00e9fini \u2014 en pratique, souvent une puret\u00e9 de pic sup\u00e9rieure \u00e0 98\u00a0% sans pics voisins significatifs \u2014 peuvent \u00eatre regroup\u00e9es en un seul pool. Les fractions situ\u00e9es juste en dessous de cette limite, ou celles dans lesquelles un pic en \u00e9paulement chevauche le pic principal, sont mises de c\u00f4t\u00e9 ou \u00e9cart\u00e9es.<\/p>\n
Cette s\u00e9lection est un \u00e9quilibre\u00a0: un regroupement trop strict donne un rendement plus faible, un regroupement trop large dilue la puret\u00e9 du lot final. Les \u00e9quipes de recherche consignent les limites appliqu\u00e9es et les raisons de l’inclusion ou de l’exclusion de chaque fraction, de sorte que la composition du pool reste tra\u00e7able jusqu’au niveau de la fraction.<\/p>\n
Les peptides construits par synth\u00e8se Fmoc en phase solide sont g\u00e9n\u00e9ralement isol\u00e9s apr\u00e8s clivage sous forme de sel de trifluoroac\u00e9tate (TFA)\u00a0: l’\u00e9luant de l’HPLC pr\u00e9parative contient du TFA comme r\u00e9actif d’appariement d’ions, et cet acide reste associ\u00e9 au squelette peptidique. Pour certaines applications de recherche, cela ne pose pas de probl\u00e8me, mais le TFA peut interf\u00e9rer dans certains essais ou affecter les propri\u00e9t\u00e9s physico-chimiques de l’\u00e9chantillon. C’est pourquoi les laboratoires choisissent parfois de remplacer le contre-ion par de l’ac\u00e9tate ou du chlorure, qui pr\u00e9sentent tous deux un profil d’interf\u00e9rence plus favorable dans les analyses ult\u00e9rieures.<\/p>\n
Il existe plusieurs voies pour \u00e9changer le contre-ion. Une m\u00e9thode couramment utilis\u00e9e consiste en des lyophilisations r\u00e9p\u00e9t\u00e9es \u00e0 partir d’un acide dilu\u00e9 du contre-ion souhait\u00e9, par exemple l’acide ac\u00e9tique, le TFA \u00e9tant progressivement remplac\u00e9 au fil de cycles r\u00e9p\u00e9t\u00e9s de dissolution et d’\u00e9vaporation. Une autre voie passe par une r\u00e9sine \u00e9changeuse d’ions\u00a0: l’\u00e9chantillon est pass\u00e9 sur une colonne portant le contre-ion souhait\u00e9, ce qui \u00e9change le TFA tandis que le peptide se lie \u00e0 la matrice ou la traverse, selon le protocole choisi. Les deux voies n\u00e9cessitent un contr\u00f4le ult\u00e9rieur \u2014 g\u00e9n\u00e9ralement \u00e0 nouveau une HPLC analytique, ou une chromatographie ionique \u2014 pour confirmer que l’\u00e9change de contre-ion a \u00e9t\u00e9 men\u00e9 \u00e0 terme et qu’il ne subsiste aucune contamination crois\u00e9e par le contre-ion pr\u00e9c\u00e9dent.<\/p>\n
Outre l’\u00e9change de contre-ion, un \u00e9chantillon doit souvent encore \u00eatre dessal\u00e9\u00a0: les sels de tampon et les autres composants non volatils de la phase mobile doivent \u00eatre \u00e9limin\u00e9s avant que l’\u00e9chantillon ne convienne \u00e0 des techniques sensibles telles que la LC-MS. L’extraction en phase solide en phase inverse, g\u00e9n\u00e9ralement sur mat\u00e9riau C18, est une approche courante\u00a0: le peptide se lie au sorbant tandis que les sels sont \u00e9limin\u00e9s par lavage avec une phase aqueuse, apr\u00e8s quoi le peptide est \u00e9lu\u00e9 avec un solvant organique. C’est aussi la raison pour laquelle \u00ab\u00a0pur en HPLC\u00a0\u00bb et \u00ab\u00a0adapt\u00e9 \u00e0 la spectrom\u00e9trie de masse\u00a0\u00bb sont deux crit\u00e8res de qualit\u00e9 diff\u00e9rents \u2014 une fraction peut \u00eatre excellente en termes de puret\u00e9 peptidique et contenir n\u00e9anmoins un r\u00e9sidu de sel qui perturbe l’analyse MS.<\/p>\n
Une fois le pool constitu\u00e9, le contre-ion \u00e9tabli ou \u00e9chang\u00e9 et les sels \u00e9limin\u00e9s, vient la lyophilisation en une poudre stable \u2014 sujet de pr\u00e9c\u00e9dentes analyses de ce blog consacr\u00e9es \u00e0 la lyophilisation et \u00e0 l’humidit\u00e9 r\u00e9siduelle. Chaque \u00e9tape de cette cha\u00eene (s\u00e9lection des fractions, statut du contre-ion, m\u00e9thode de dessalage) a sa place dans le dossier analytique du lot, \u00e0 c\u00f4t\u00e9 des donn\u00e9es habituelles du CoA. Ainsi, l’origine d’un \u00e9chantillon de recherche reste enti\u00e8rement reconstituable, de la s\u00e9paration HPLC jusqu’\u00e0 la poudre finale.<\/p>\n
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