Gdy peptyd badawczy przeszed\u0142 preparatywne oczyszczanie metod\u0105 HPLC i wymian\u0119 przeciwjonu, pozostaje zasadnicze pytanie: czy podawany procent czysto\u015bci jest rzeczywi\u015bcie prawid\u0142owy? RP-HPLC jest standardem bran\u017cowym, ale \u017cadna technika rozdzielania nie jest nieomylna. Elektroforeza kapilarna (CE) oferuje ortogonaln\u0105 kontrol\u0119, kt\u00f3ra mo\u017ce uwidoczni\u0107 martwe punkty chromatografii \u2014 i zas\u0142uguje na sta\u0142e miejsce w zestawie narz\u0119dzi analitycznych ka\u017cdego laboratorium badawczego pracuj\u0105cego z syntetycznymi peptydami.<\/p>\n
RP-HPLC rozdziela cz\u0105steczki na podstawie hydrofobowo\u015bci: im silniej peptyd wi\u0105\u017ce si\u0119 z faz\u0105 stacjonarn\u0105, tym p\u00f3\u017aniej ulega elucji. Dzia\u0142a to doskonale, ale ma ograniczenie strukturalne. Dwa warianty peptydu o niemal identycznym charakterze hydrofobowym \u2014 na przyk\u0142ad produkt deamidacji albo peptyd z jednym b\u0142\u0119dnie przy\u0142\u0105czonym aminokwasem z wcze\u015bniejszego etapu syntezy \u2014 mog\u0105 wsp\u00f3\u0142eluowa\u0107 i znikn\u0105\u0107 w tym samym piku chromatograficznym. Podawana warto\u015b\u0107 czysto\u015bci wygl\u0105da wtedy na wy\u017csz\u0105 ni\u017c rzeczywisty sk\u0142ad pr\u00f3bki.<\/p>\n
W chemii analitycznej problem ten znany jest jako ryzyko metody nieortogonalnej: je\u015bli druga kontrola rozdziela wed\u0142ug tej samej zasady fizycznej co pierwsza, te same zanieczyszczenia zostaj\u0105 pomini\u0119te. Ortogonalno\u015b\u0107 oznacza, \u017ce druga technika rozdziela wed\u0142ug zasadniczo innej zasady, tak aby zanieczyszczenia, kt\u00f3rych nie wychwyci pierwsza metoda, mimo wszystko wysz\u0142y na jaw.<\/p>\n
CE rozdziela cz\u0105steczki na podstawie ich ruchliwo\u015bci elektroforetycznej w polu elektrycznym wewn\u0105trz cienkiej kapilary krzemionkowej wype\u0142nionej buforem. Ruchliwo\u015b\u0107 ta zale\u017cy od stosunku \u0142adunku do masy peptydu, a nie od hydrofobowo\u015bci. Deamidacja przekszta\u0142caj\u0105ca amidowy \u0142a\u0144cuch boczny w kwas karboksylowy prawie nie zmienia retencji w RP-HPLC, ale w wymierny spos\u00f3b przesuwa \u0142adunek wypadkowy peptydu \u2014 a wraz z nim czas migracji w CE.<\/p>\n
Poniewa\u017c mechanizm rozdzielania tak bardzo r\u00f3\u017cni si\u0119 od chromatografii, kapilarna elektroforeza strefowa (CZE) dzia\u0142a obok RP-HPLC jako klasyczna technika ortogonalna. Tam, gdzie chromatografia pyta \u201ejak t\u0142usta lub hydrofobowa jest ta cz\u0105steczka\u201d, CE pyta \u201ejak du\u017cy \u0142adunek nosi ta cz\u0105steczka i jak szybko migruje\u201d. Zanieczyszczenia, kt\u00f3re przypadkiem odpowiadaj\u0105 produktowi g\u0142\u00f3wnemu w obu wymiarach, s\u0105 rzadkie, co czyni po\u0142\u0105czenie obu metod szczeg\u00f3lnie skutecznym.<\/p>\n
W opublikowanych badaniach analitycznych elektroforez\u0119 kapilarn\u0105 wielokrotnie wykorzystywano do wykrywania zanieczyszcze\u0144, kt\u00f3rych sama RP-HPLC nie wychwyci\u0142a, w\u0142a\u015bnie w peptydach wykazuj\u0105cych ju\u017c po oczyszczaniu preparatywnym wysok\u0105 warto\u015b\u0107 czysto\u015bci w HPLC. Typowe przypadki to:<\/p>\n
CE nie jest wi\u0119c zamiennikiem RP-HPLC, lecz dodatkow\u0105 kontrol\u0105 obejmuj\u0105c\u0105 w\u0142a\u015bnie s\u0142abe punkty chromatografii \u2014 szczeg\u00f3lnie istotn\u0105 zaraz po preparatywnym etapie oczyszczania, gdy partia otrzymuje swoj\u0105 ostateczn\u0105 dokumentacj\u0119.<\/p>\n
Analiza peptyd\u00f3w metod\u0105 CE wymaga szeregu konkretnych decyzji. Sk\u0142ad buforu i pH w du\u017cej mierze determinuj\u0105 \u0142adunek wypadkowy, a tym samym rozdzielanie: przy pH odleg\u0142ym od punktu izoelektrycznego peptydu \u0142adunek jest najwi\u0119kszy, a wraz z nim rozdzielczo\u015b\u0107 cz\u0119sto najlepsza. Kapilary z krzemionki topionej o ma\u0142ej obj\u0119to\u015bci wewn\u0119trznej ograniczaj\u0105 poszerzanie pasm, a detekcja UV przy 200\u2013220 nm (gdzie absorbuje wi\u0105zanie peptydowe) jest zwyk\u0142\u0105 metod\u0105 odczytu. Dla potwierdzenia to\u017csamo\u015bci obok czysto\u015bci CE mo\u017cna te\u017c sprz\u0119gn\u0105\u0107 ze spektrometri\u0105 mas (CE-MS), \u0142\u0105cz\u0105c rozdzielanie i oznaczanie masy w jednym procesie pracy.<\/p>\n
Poniewa\u017c czasy migracji w CE s\u0105 bardziej wra\u017cliwe na niewielkie wahania buforu, temperatury i stanu kapilary ni\u017c czasy retencji w HPLC, walidacja metody z u\u017cyciem odpowiednich wzorc\u00f3w odniesienia jest niezb\u0119dna, zanim dane CE zostan\u0105 w\u0142\u0105czone obok danych HPLC do raportu analitycznego.<\/p>\n
Dla grupy badawczej, kt\u00f3ra sama syntetyzuje i oczyszcza w\u0142asne partie, dodanie techniki ortogonalnej takiej jak CE jest logicznym kolejnym krokiem po \u0142a\u0144cuchu oczyszczania obejmuj\u0105cym odszczepienie, preparatywn\u0105 HPLC i \u0142\u0105czenie frakcji. Warto\u015b\u0107 na certyfikacie analizy nigdy nie jest mocniejsza ni\u017c metoda, kt\u00f3r\u0105 j\u0105 oznaczono; po\u0142\u0105czenie dw\u00f3ch zasadniczo r\u00f3\u017cnych zasad rozdzielania daje znacznie bardziej wiarygodny obraz rzeczywistego sk\u0142adu pr\u00f3bki badawczej.<\/p>\n
Zastrze\u017cenie: produkty i informacje na tej stronie s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, do zastosowa\u0144 diagnostycznych ani do stosowania terapeutycznego.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Gdy peptyd badawczy przeszed\u0142 preparatywne oczyszczanie metod\u0105 HPLC i wymian\u0119 przeciwjonu, pozostaje zasadnicze pytanie: czy podawany procent czysto\u015bci jest rzeczywi\u015bcie prawid\u0142owy? RP-HPLC jest standardem bran\u017cowym, ale \u017cadna technika rozdzielania nie jest nieomylna. Elektroforeza kapilarna (CE) oferuje ortogonaln\u0105 kontrol\u0119, kt\u00f3ra mo\u017ce uwidoczni\u0107 martwe punkty chromatografii \u2014 i zas\u0142uguje na sta\u0142e miejsce w zestawie narz\u0119dzi analitycznych ka\u017cdego […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1373","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1373","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1373"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1373\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81910,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1373\/revisions\/81910"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1373"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1373"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1373"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}