W syntezie peptyd\u00f3w badawczych metod\u0105 Fmoc-SPPS nie ka\u017cdy etap sprz\u0119gania przebiega w stu procentach. Niewielki odsetek grup aminowych pozostaje nieprzereagowany, a bez interwencji te pomini\u0119te sprz\u0119gania kumuluj\u0105 si\u0119 w mieszanin\u0119 produkt\u00f3w ubocznych, kt\u00f3ra obni\u017ca ostateczn\u0105 czysto\u015b\u0107 materia\u0142u badawczego. Centraln\u0105 rol\u0119 odgrywaj\u0105 tu dwa mechanizmy: capping (blokowanie) i racemizacja. W tym artykule opisujemy, jak powstaj\u0105, dlaczego maj\u0105 znaczenie dla jako\u015bci partii peptydu i jak laboratoria uwzgl\u0119dniaj\u0105 je w strategii syntezy.<\/p>\n
Podczas ka\u017cdego cyklu sprz\u0119gania w SPPS aktywowany aminokwas reaguje z woln\u0105 grup\u0105 aminow\u0105 rosn\u0105cego peptydu na \u017cywicy. W praktyce reakcja ta nigdy nie jest ca\u0142kowita: cz\u0119\u015b\u0107 grup aminowych pozostaje nieprzereagowana, zwykle rz\u0119du u\u0142amka procenta na ka\u017cdy etap. W przypadku peptydu z\u0142o\u017conego z dwudziestu lub trzydziestu reszt to si\u0119 sumuje.<\/p>\n
Capping to etap, w kt\u00f3rym te pozosta\u0142e, nieprzereagowane grupy aminowe zostaj\u0105 celowo zablokowane \u2014 zwykle za pomoc\u0105 odczynnika acetyluj\u0105cego, takiego jak bezwodnik octowy. Celem nie jest naprawienie b\u0142\u0119du, lecz zapobie\u017cenie dalszemu wyd\u0142u\u017caniu si\u0119 nieprzereagowanego \u0142a\u0144cucha w kolejnych cyklach. Zablokowany \u0142a\u0144cuch zatrzymuje si\u0119 w tym miejscu i w trakcie syntezy staje si\u0119 fizycznie kr\u00f3tszy od zamierzonego produktu ko\u0144cowego.<\/p>\n
Bez cappingu nieprzereagowany \u0142a\u0144cuch po prostu wzi\u0105\u0142by udzia\u0142 w nast\u0119pnej rundzie sprz\u0119gania, jak gdyby nic si\u0119 nie sta\u0142o. Wynikiem jest peptyd, w kt\u00f3rym po prostu brakuje jednego aminokwasu: sekwencja delecyjna. Poniewa\u017c sekwencje te s\u0105 bliskie po\u017c\u0105danemu produktowi pod wzgl\u0119dem masy, a cz\u0119sto tak\u017ce czasu retencji, s\u0105 wyj\u0105tkowo trudne do rozdzielenia standardow\u0105 chromatografi\u0105 HPLC w uk\u0142adzie faz odwr\u00f3conych.<\/p>\n
Dzi\u0119ki celowemu cappingowi zamiast sekwencji delecyjnej powstaje silnie skr\u00f3cony, zablokowany \u0142a\u0144cuch. Ten kr\u00f3tszy fragment znacznie bardziej r\u00f3\u017cni si\u0119 pod wzgl\u0119dem fizykochemicznym od kompletnego peptydu, co znacznie u\u0142atwia rozdzia\u0142 podczas oczyszczania. Capping przenosi zatem problem z kategorii \u201eprawie niemo\u017cliwe do rozdzielenia\u201d do kategorii \u201estosunkowo \u0142atwe do usuni\u0119cia\u201d.<\/p>\n
Opr\u00f3cz delecji na samym etapie sprz\u0119gania rol\u0119 odgrywa racemizacja. Podczas aktywacji aminokwasu mo\u017ce powsta\u0107 zwi\u0105zek po\u015bredni \u2014 pier\u015bcie\u0144 oksazolonowy \u2014 kt\u00f3ry poprzez enolizacj\u0119 mo\u017ce odwr\u00f3ci\u0107 konfiguracj\u0119 centrum stereogenicznego aminokwasu. Konsekwencj\u0105 jest D-aminokwas w pozycji, w kt\u00f3rej zamierzony by\u0142 L-aminokwas, co daje diastereoizomer docelowego peptydu, a nie delecj\u0119 czy skr\u00f3cenie \u0142a\u0144cucha.<\/p>\n
Ryzyko to nie jest jednakowe dla wszystkich aminokwas\u00f3w: cysteina i histydyna s\u0105 znane ze szczeg\u00f3lnej podatno\u015bci na racemizacj\u0119 podczas sprz\u0119gania. Dodatki takie jak HOBt lub OxymaPure, cz\u0119sto obecne ju\u017c przy stosowaniu odczynnik\u00f3w sprz\u0119gaj\u0105cych takich jak HBTU lub HATU, hamuj\u0105 powstawanie podatnego na racemizacj\u0119 zwi\u0105zku po\u015bredniego i utrzymuj\u0105 niski udzia\u0142 D-aminokwasu.<\/p>\n
Sekwencje delecyjne i produkty racemizacji nale\u017c\u0105 do najwa\u017cniejszych \u017ar\u00f3de\u0142 zanieczyszcze\u0144 w syntetycznych peptydach badawczych, obok utleniania i innych dr\u00f3g degradacji, kt\u00f3re mog\u0105 wyst\u0105pi\u0107 po syntezie. Dla badacza oceniaj\u0105cego CoA wyja\u015bnia to, dlaczego warto\u015bci czysto\u015bci, chromatogramy oraz \u2014 w stosownych przypadkach \u2014 analiza chiralna razem daj\u0105 pe\u0142niejszy obraz ni\u017c pojedynczy procent czysto\u015bci. Peptyd mo\u017ce wygl\u0105da\u0107 na analitycznie czysty pod wzgl\u0119dem masy, podczas gdy mimo to obecny jest niewielki udzia\u0142 diastereoizomeru, kt\u00f3ry staje si\u0119 widoczny dopiero przy u\u017cyciu ukierunkowanych technik.<\/p>\n
Dla laboratori\u00f3w, kt\u00f3re same prowadz\u0105 lub oceniaj\u0105 syntez\u0119 peptyd\u00f3w, capping nie jest zatem etapem opcjonalnym, lecz sta\u0142ym elementem solidnego protoko\u0142u syntezy, podobnie jak wyb\u00f3r odczynnika sprz\u0119gaj\u0105cego i ortogonalno\u015b\u0107 grup ochronnych.<\/p>\n
Capping i t\u0142umienie racemizacji to dwa mniej widoczne, ale niezb\u0119dne ogniwa \u0142\u0105cz\u0105ce surowy produkt syntezy z u\u017cytecznym, dobrze scharakteryzowanym peptydem badawczym. Pokazuj\u0105 one, \u017ce czysto\u015b\u0107 peptydu nie jest wy\u0142\u0105cznie kwesti\u0105 p\u00f3\u017aniejszego oczyszczania, lecz w r\u00f3wnym stopniu wybor\u00f3w dokonywanych w trakcie samej syntezy.<\/p>\n
Te informacje s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Produkty i informacje Dutch Peptide Labs nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi lub zwierz\u0119ta, do u\u017cytku diagnostycznego ani do zastosowa\u0144 terapeutycznych.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" W syntezie peptyd\u00f3w badawczych metod\u0105 Fmoc-SPPS nie ka\u017cdy etap sprz\u0119gania przebiega w stu procentach. Niewielki odsetek grup aminowych pozostaje nieprzereagowany, a bez interwencji te pomini\u0119te sprz\u0119gania kumuluj\u0105 si\u0119 w mieszanin\u0119 produkt\u00f3w ubocznych, kt\u00f3ra obni\u017ca ostateczn\u0105 czysto\u015b\u0107 materia\u0142u badawczego. Centraln\u0105 rol\u0119 odgrywaj\u0105 tu dwa mechanizmy: capping (blokowanie) i racemizacja. W tym artykule opisujemy, jak powstaj\u0105, dlaczego […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1374","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1374","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1374"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1374\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81911,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1374\/revisions\/81911"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1374"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1374"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1374"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}