W wielu uk\u0142adach badawczych nie wystarcza wiedza, \u017ce peptyd uczestniczy w okre\u015blonym oddzia\u0142ywaniu \u2014 chce si\u0119 te\u017c to oddzia\u0142ywanie \u015bledzi\u0107, zmierzy\u0107 lub zobrazowa\u0107. Do tego celu peptyd cz\u0119sto sprz\u0119ga si\u0119 z barwnikiem fluorescencyjnym albo z biotyn\u0105, niewielk\u0105 cz\u0105steczk\u0105 wi\u0105\u017c\u0105c\u0105 streptawidyn\u0119 z wysokim powinowactwem. Techniki znakowania stanowi\u0105 podstaw\u0119 niezliczonych test\u00f3w in vitro, od bada\u0144 wi\u0105zania po badania obrazowe na poziomie kultur kom\u00f3rkowych. Ten artyku\u0142 przedstawia przegl\u0105d popularnych znacznik\u00f3w, chemii, kt\u00f3ra za nimi stoi, oraz praktycznych zagadnie\u0144 zwi\u0105zanych z prac\u0105 ze znakowanymi peptydami badawczymi.<\/p>\n
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) jest jednym z najcz\u0119\u015bciej stosowanych znacznik\u00f3w fluorescencyjnych w badaniach peptyd\u00f3w, przede wszystkim z powodu niskiego kosztu i szerokiej dost\u0119pno\u015bci aparatury detekcyjnej dopasowanej do jego widma wzbudzenia i emisji. FITC reaguje g\u0142\u00f3wnie z pierwszorz\u0119dowymi aminami \u2014 takimi jak N-koniec peptydu lub \u0142a\u0144cuch boczny lizyny \u2014 tworz\u0105c wi\u0105zanie tiomocznikowe. Alternatywne znaczniki, takie jak TAMRA, Cy3 czy Cy5, wybiera si\u0119 cz\u0119sto wtedy, gdy potrzebny jest inny zakres d\u0142ugo\u015bci fali, na przyk\u0142ad aby unikn\u0105\u0107 nak\u0142adania si\u0119 widm z innymi fluoroforami w uk\u0142adzie multipleksowym, albo gdy fotostabilno\u015b\u0107 ma wi\u0119ksze znaczenie ni\u017c w przypadku FITC.<\/p>\n
Wa\u017cnym zagadnieniem przy znakowaniu fluorescencyjnym jest miejsce sprz\u0119gania. Znakowanie na N-ko\u0144cu zwykle mniej zaburza funkcjonalny rdze\u0144 peptydu ni\u017c znakowanie na wewn\u0119trznym \u0142a\u0144cuchu bocznym, ale zale\u017cy to w du\u017cej mierze od konkretnej sekwencji i roli tego \u0142a\u0144cucha bocznego w badanym oddzia\u0142ywaniu. Literatura cz\u0119sto zaleca wi\u0119c, tam gdzie to mo\u017cliwe, por\u00f3wnanie kilku miejsc znakowania, zanim znakowany peptyd zostanie uznany za reprezentatywny dla cz\u0105steczki nieznakowanej.<\/p>\n
Obok znacznik\u00f3w fluorescencyjnych biotyna jest szeroko stosowana jako znacznik funkcjonalny. Powinowactwo mi\u0119dzy biotyn\u0105 a streptawidyn\u0105 nale\u017cy do najsilniejszych znanych w biochemii oddzia\u0142ywa\u0144 niekowalencyjnych, co czyni biotynylacj\u0119 szczeg\u00f3lnie odpowiedni\u0105 dla test\u00f3w, w kt\u00f3rych peptyd musi zosta\u0107 unieruchomiony na powierzchni \u2014 na przyk\u0142ad w uk\u0142adach typu ELISA, w chromatografii powinowactwa czy w rezonansie plazmon\u00f3w powierzchniowych. Biotyn\u0119 sprz\u0119ga si\u0119 zwykle przez rami\u0119 \u0142\u0105cznikowe, takie jak kwas aminoheksanowy lub \u0142\u0105cznik PEG, aby zminimalizowa\u0107 zawad\u0119 steryczn\u0105 mi\u0119dzy peptydem a powierzchni\u0105 ze streptawidyn\u0105.<\/p>\n
Kombinacje takie jak FITC-PEG-biotyna, \u0142\u0105cz\u0105ce funkcj\u0119 fluorescencyjn\u0105 i powinowactwa w jednej cz\u0105steczce, stosuje si\u0119 w uk\u0142adach wymagaj\u0105cych zar\u00f3wno detekcji wizualnej (optycznej), jak i trwa\u0142ego sprz\u0119gania. Wyb\u00f3r i d\u0142ugo\u015b\u0107 \u0142\u0105cznika PEG wp\u0142ywaj\u0105 zar\u00f3wno na rozpuszczalno\u015b\u0107 znakowanego peptydu, jak i na dost\u0119pno\u015b\u0107 motywu biotynowego dla streptawidyny.<\/p>\n
Dodanie znacznika nigdy nie jest chemicznie neutralne. Barwniki fluorescencyjne takie jak FITC s\u0105 wzgl\u0119dnie du\u017cymi, aromatycznymi strukturami, kt\u00f3re mog\u0105 zmieni\u0107 polarno\u015b\u0107 i rozpuszczalno\u015b\u0107 peptydu, a w niekt\u00f3rych przypadkach sprzyja\u0107 agregacji. Badacze dokumentuj\u0105 zatem najlepiej nie tylko sekwencj\u0119 znakowanego peptydu, lecz tak\u017ce sam znacznik, miejsce sprz\u0119gania oraz wszelkie zmiany czasu retencji w analizie HPLC w por\u00f3wnaniu z odpowiednikiem nieznakowanym. Spektrometri\u0119 mas stosuje si\u0119 cz\u0119sto w celu potwierdzenia, \u017ce reakcja znakowania przebieg\u0142a ca\u0142kowicie i specyficznie, poniewa\u017c niepe\u0142ne znakowanie mo\u017ce da\u0107 mieszanin\u0119 materia\u0142u znakowanego i nieznakowanego, co utrudnia interpretacj\u0119 wynik\u00f3w testu.<\/p>\n
Fotostabilno\u015b\u0107 to kolejny punkt wymagaj\u0105cy uwagi: peptydy sprz\u0119\u017cone z FITC s\u0105 wzgl\u0119dnie podatne na fotowybielanie przy d\u0142ugotrwa\u0142ej ekspozycji na \u015bwiat\u0142o, co oznacza, \u017ce przechowywanie i obchodzenie si\u0119 z nimi odbywa si\u0119 najlepiej w warunkach zaciemnionych lub os\u0142oni\u0119tych, aby ograniczy\u0107 utrat\u0119 sygna\u0142u podczas p\u00f3\u017aniejszych pomiar\u00f3w.<\/p>\n
Poniewa\u017c znacznik zmienia w\u0142a\u015bciwo\u015bci fizykochemiczne peptydu, zwykle charakteryzuje si\u0119 znakowane partie odr\u0119bnie od nieznakowanego prekursora. Certyfikat analizy znakowanego peptydu zawiera najlepiej zar\u00f3wno dane dotycz\u0105ce masy i czysto\u015bci produktu ko\u0144cowego, jak i informacj\u0119 o wydajno\u015bci znakowania, tak aby badacze wiedzieli, jaki procent materia\u0142u rzeczywi\u015bcie nosi zamierzony znacznik. Ten dodatkowy etap charakterystyki jest jedn\u0105 z przyczyn, dla kt\u00f3rych znakowane peptydy maj\u0105 zasadniczo d\u0142u\u017cszy czas realizacji i surowsze wymagania dokumentacyjne ni\u017c ich nieznakowane odpowiedniki.<\/p>\n
Znakowanie fluorescencyjne i biotynowe nale\u017c\u0105 do najcz\u0119\u015bciej stosowanych technik uwidaczniania i mierzenia oddzia\u0142ywa\u0144 peptyd\u00f3w w badaniach laboratoryjnych. Wyb\u00f3r znacznika, chemia sprz\u0119gania i miejsce na peptydzie wp\u0142ywaj\u0105 na przydatno\u015b\u0107 produktu ko\u0144cowego, a starannie przeprowadzona charakterystyka pozostaje niezb\u0119dna dla zapewnienia wiarygodnych wynik\u00f3w bada\u0144.<\/p>\n
Te produkty i informacje s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, do zastosowa\u0144 diagnostycznych ani do stosowania terapeutycznego.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Dlaczego badacze znakuj\u0105 peptydy W wielu uk\u0142adach badawczych nie wystarcza wiedza, \u017ce peptyd uczestniczy w okre\u015blonym oddzia\u0142ywaniu \u2014 chce si\u0119 te\u017c to oddzia\u0142ywanie \u015bledzi\u0107, zmierzy\u0107 lub zobrazowa\u0107. Do tego celu peptyd cz\u0119sto sprz\u0119ga si\u0119 z barwnikiem fluorescencyjnym albo z biotyn\u0105, niewielk\u0105 cz\u0105steczk\u0105 wi\u0105\u017c\u0105c\u0105 streptawidyn\u0119 z wysokim powinowactwem. Techniki znakowania stanowi\u0105 podstaw\u0119 niezliczonych test\u00f3w in vitro, […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1385","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1385","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1385"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1385\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81926,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1385\/revisions\/81926"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1385"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1385"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1385"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}