Ka\u017cdy, kto regularnie pracuje z liofilizowanymi peptydami badawczymi, zna ten problem: peptyd, kt\u00f3ry wed\u0142ug certyfikatu powinien by\u0107 ca\u0142kowicie rozpuszczalny, mimo to m\u0119tnieje w okre\u015blonym buforze lub wytr\u0105ca si\u0119 po kilku godzinach. Wyja\u015bnienie cz\u0119sto nie le\u017cy w czysto\u015bci pr\u00f3bki, lecz we w\u0142a\u015bciwo\u015bci, kt\u00f3rej w protoko\u0142ach laboratoryjnych po\u015bwi\u0119ca si\u0119 zbyt ma\u0142o uwagi: punkcie izoelektrycznym (pI) sekwencji peptydowej. W tym artykule om\u00f3wiono, czym w\u0142a\u015bciwie jest pI, dlaczego decyduje o rozpuszczalno\u015bci i sk\u0142onno\u015bci peptydu do agregacji oraz jak badacze mog\u0105 wykorzysta\u0107 t\u0119 informacj\u0119 przy planowaniu eksperyment\u00f3w.<\/p>\n
Punkt izoelektryczny to warto\u015b\u0107 pH, przy kt\u00f3rej peptyd nie ma \u0142adunku elektrycznego netto. Poni\u017cej tego pH \u0142adunek netto jest dodatni, poniewa\u017c zasadowe \u0142a\u0144cuchy boczne (na przyk\u0142ad lizyny, argininy lub histydyny) s\u0105 sprotonowane; powy\u017cej tego pH dominuje \u0142adunek ujemny reszt kwasowych, takich jak kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, wraz z wolnym ko\u0144cem karboksylowym. Warto\u015b\u0107 pI zale\u017cy od pe\u0142nego sk\u0142adu aminokwasowego i sekwencji peptydu i mo\u017cna j\u0105 oszacowa\u0107 za pomoc\u0105 istniej\u0105cych modeli obliczeniowych na podstawie warto\u015bci pKa obecnych \u0142a\u0144cuch\u00f3w bocznych.<\/p>\n
Peptyd o silnym \u0142adunku netto \u2014 dodatnim lub ujemnym \u2014 w roztworze odpycha si\u0119 elektrostatycznie od innych cz\u0105steczek tego samego peptydu. To wzajemne odpychanie utrzymuje poszczeg\u00f3lne cz\u0105steczki peptydu z dala od siebie i sprzyja rozpuszczalno\u015bci. W pobli\u017cu pI ta si\u0142a odpychania jednak w du\u017cej mierze zanika: \u0142adunek netto wynosi zero, przez co oddzia\u0142ywania hydrofobowe i wi\u0105zania wodorowe mi\u0119dzy cz\u0105steczkami peptydu staj\u0105 si\u0119 relatywnie silniejsze. To w\u0142a\u015bnie w tym punkcie wytr\u0105canie lub agregacja s\u0105 najbardziej prawdopodobne. Dla badaczy oznacza to, \u017ce wyb\u00f3r buforu, kt\u00f3ry zbli\u017ca pH roztworu do pI sekwencji peptydowej, wi\u0105\u017ce si\u0119 ze zwi\u0119kszonym ryzykiem wytr\u0105cania, niezale\u017cnie od tego, jak czysty jest materia\u0142 wyj\u015bciowy.<\/p>\n
Widoczne zm\u0119tnienie jest najbardziej oczywistym przejawem agregacji, ale nie jedynym. Peptydy o wyra\u017anie hydrofobowym charakterze mog\u0105 przy warto\u015bciach pH w pobli\u017cu swojego pI tworzy\u0107 tak\u017ce oligomery lub struktury uporz\u0105dkowane, kt\u00f3re nie s\u0105 widoczne go\u0142ym okiem, ale obni\u017caj\u0105 efektywne st\u0119\u017cenie peptydu monomerycznego w pr\u00f3bce. Opublikowane badania sekwencji peptydowych tworz\u0105cych amyloid pokazuj\u0105 na przyk\u0142ad, \u017ce wzajemne oddzia\u0142ywanie pH, \u0142adunku netto i hydrofobowo\u015bci decyduje o tym, jak\u0105 drog\u0105 fa\u0142dowania i agregacji pod\u0105\u017ca peptyd. W analizach ilo\u015bciowych \u2014 takich jak oznaczenia metod\u0105 UV-Vis lub AAA \u2014 ma to znaczenie: pr\u00f3bka, kt\u00f3ra cz\u0119\u015bciowo uleg\u0142a agregacji, niekoniecznie daje reprezentatywny pomiar rzeczywistego st\u0119\u017cenia peptydu.<\/p>\n
Dla wi\u0119kszo\u015bci standardowych sekwencji przybli\u017con\u0105 warto\u015b\u0107 pI mo\u017cna oszacowa\u0107 za pomoc\u0105 og\u00f3lnodost\u0119pnych narz\u0119dzi obliczeniowych, kt\u00f3re przyjmuj\u0105 sk\u0142ad aminokwasowy jako dane wej\u015bciowe. W przypadku peptyd\u00f3w modyfikowanych \u2014 z acetylowanym N-ko\u0144cem, amidowanym C-ko\u0144cem lub aminokwasami nienaturalnymi \u2014 wskazana jest dodatkowa ostro\u017cno\u015b\u0107, poniewa\u017c standardowe modele nie zawsze prawid\u0142owo uwzgl\u0119dniaj\u0105 te modyfikacje. W takim przypadku zaleca si\u0119 po\u0142\u0105czenie oszacowania pI z prostym testem rozpuszczalno\u015bci: niewielk\u0105 ilo\u015b\u0107 peptydu rekonstytuuje si\u0119 w zamierzonym buforze i przez kilka godzin wzrokowo sprawdza roztw\u00f3r pod k\u0105tem zm\u0119tnienia, zanim przygotuje si\u0119 pe\u0142ny eksperyment.<\/p>\n
Gdy znana jest szacunkowa warto\u015b\u0107 pI sekwencji, pH buforu roboczego mo\u017cna \u015bwiadomie dobra\u0107 w odniesieniu do niej. Og\u00f3lna praktyczna zasada m\u00f3wi, \u017ce pH oddalone od pI o co najmniej jedn\u0105 do dw\u00f3ch jednostek zwykle daje wi\u0119kszy \u0142adunek netto, a tym samym stabilniejszy roztw\u00f3r ni\u017c pH bliskie pI. W przypadku peptyd\u00f3w o niskim pI (sekwencji o przewadze reszt kwasowych) oznacza to cz\u0119sto, \u017ce lepiej sprawdza si\u0119 bufor lekko zasadowy, natomiast sekwencje zasadowe o wysokim pI mog\u0105 zyska\u0107 na zastosowaniu buforu lekko kwa\u015bnego. To kryterium jest niezale\u017cne od innych czynnik\u00f3w wp\u0142ywaj\u0105cych na wyb\u00f3r buforu, takich jak zgodno\u015b\u0107 z technik\u0105 analityczn\u0105 stosowan\u0105 w dalszych etapach, i dlatego pe\u0142ni rol\u0119 kryterium dodatkowego, a nie zast\u0119pczego.<\/p>\n
Produkty i informacje Dutch Peptide Labs s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, do zastosowa\u0144 diagnostycznych ani do zastosowa\u0144 terapeutycznych.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Ka\u017cdy, kto regularnie pracuje z liofilizowanymi peptydami badawczymi, zna ten problem: peptyd, kt\u00f3ry wed\u0142ug certyfikatu powinien by\u0107 ca\u0142kowicie rozpuszczalny, mimo to m\u0119tnieje w okre\u015blonym buforze lub wytr\u0105ca si\u0119 po kilku godzinach. Wyja\u015bnienie cz\u0119sto nie le\u017cy w czysto\u015bci pr\u00f3bki, lecz we w\u0142a\u015bciwo\u015bci, kt\u00f3rej w protoko\u0142ach laboratoryjnych po\u015bwi\u0119ca si\u0119 zbyt ma\u0142o uwagi: punkcie izoelektrycznym (pI) sekwencji peptydowej. […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1392","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1392","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1392"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1392\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81935,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1392\/revisions\/81935"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1392"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1392"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1392"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}