Synteza peptyd\u00f3w na fazie sta\u0142ej (SPPS) to standardowa metoda wytwarzania peptyd\u00f3w badawczych, reszta po reszcie, na sta\u0142ym no\u015bniku \u017cywicznym. We wcze\u015bniejszych artyku\u0142ach na tym blogu om\u00f3wili\u015bmy elementy sk\u0142adowe tego procesu: grupy ochronne, wyb\u00f3r \u017cywicy, odczynniki sprz\u0119gaj\u0105ce oraz odszczepienie, kt\u00f3re uwalnia surowy peptyd z \u017cywicy. W tym wszystkim pozostaje jednak niewypowiedziane, \u017ce SPPS ma praktyczn\u0105 granic\u0119 d\u0142ugo\u015bci. W miar\u0119 wyd\u0142u\u017cania si\u0119 \u0142a\u0144cucha kumuluj\u0105 si\u0119 niepe\u0142ne sprz\u0119gania, sekwencje delecyjne i agregacja rosn\u0105cego \u0142a\u0144cucha peptydowego na \u017cywicy. Powy\u017cej oko\u0142o 50 aminokwas\u00f3w szansa na jednorodny produkt ko\u0144cowy staje si\u0119 statystycznie coraz mniejsza, nawet przy zoptymalizowanym protokole.<\/p>\n
W badaniach d\u0142u\u017cszych peptyd\u00f3w badawczych i ma\u0142ych bia\u0142ek jest to realne w\u0105skie gard\u0142o. Rozwi\u0105zaniem opracowanym w literaturze nie jest jedna d\u0142u\u017csza synteza, lecz chemiczne \u0142\u0105czenie kilku kr\u00f3tszych fragment\u00f3w, z kt\u00f3rych ka\u017cdy wytwarza si\u0119 metod\u0105 SPPS. Najcz\u0119\u015bciej stosowan\u0105 technik\u0105 jest natywna ligacja chemiczna (NCL).<\/p>\n
NCL, pierwotnie opisana przez grup\u0119 badawcz\u0105 Stephena Kenta w latach 90. XX wieku, wykorzystuje dwa niezabezpieczone fragmenty peptydowe, kt\u00f3re reaguj\u0105 ze sob\u0105 chemoselektywnie w buforze wodnym przy oboj\u0119tnym pH. Jeden fragment ma tioester na C-ko\u0144cu, drugi woln\u0105 cystein\u0119 na N-ko\u0144cu. Poniewa\u017c oba fragmenty s\u0105 ca\u0142kowicie niezabezpieczone, po samej ligacji nie jest potrzebny osobny etap deprotekcji, co znacznie upraszcza proces w por\u00f3wnaniu z klasyczn\u0105 kondensacj\u0105 fragment\u00f3w.<\/p>\n
Reakcja przebiega w dw\u00f3ch etapach. Najpierw zachodzi transtioestryfikacja: grupa tiolowa cysteiny atakuje tioester i tworzy nowy, przej\u015bciowy tioestrowy zwi\u0105zek po\u015bredni w miejscu ligacji. Ten zwi\u0105zek po\u015bredni ulega nast\u0119pnie wewn\u0105trzcz\u0105steczkowemu przegrupowaniu acylowemu S\u2192N, w kt\u00f3rym grupa acylowa migruje z atomu siarki do grupy aminowej tej samej cysteiny. W efekcie powstaje natywne wi\u0105zanie amidowe \u2014 chemicznie nieodr\u00f3\u017cnialne od wi\u0105zania peptydowego utworzonego podczas zwyk\u0142ego sprz\u0119gania w SPPS.<\/p>\n
Ka\u017cdy fragment syntetyzuje si\u0119 i oczyszcza osobno standardow\u0105 metod\u0105 Fmoc-SPPS, dok\u0142adnie tak, jak opisali\u015bmy to wcze\u015bniej na tym blogu w odniesieniu do kr\u00f3tszych peptyd\u00f3w. Fragment C-ko\u0144cowy przekszta\u0142ca si\u0119 w tioester w trakcie syntezy lub po niej, natomiast N-ko\u0144cowy fragment kolejnego segmentu wymaga cysteiny w pierwszej pozycji. W przypadku cel\u00f3w badawczych wykraczaj\u0105cych poza to, co mog\u0105 obj\u0105\u0107 dwa fragmenty (bia\u0142ka docelowe licz\u0105ce od oko\u0142o stu do dwustu pi\u0119\u0107dziesi\u0119ciu aminokwas\u00f3w), przeprowadza si\u0119 kilka ligacji jedna po drugiej (sekwencyjnie) lub wychodz\u0105c od fragmentu centralnego (konwergentnie). Wymaga to \u015bcis\u0142ej kolejno\u015bci etap\u00f3w deprotekcji i ligacji, poniewa\u017c ka\u017cdy fragment mo\u017ce dzia\u0142a\u0107 jako reaktywny partner tylko raz, zanim nast\u0105pi kolejne sprz\u0119ganie.<\/p>\n
Najwi\u0119kszym praktycznym ograniczeniem klasycznej NCL jest wym\u00f3g obecno\u015bci cysteiny w ka\u017cdym miejscu ligacji. Nie ka\u017cda sekwencja badawcza ma w tym miejscu naturalnie cystein\u0119, a wprowadzenie dodatkowej cysteiny mo\u017ce zmieni\u0107 w\u0142a\u015bciwo\u015bci badanego obiektu. Dlatego w literaturze opisuje si\u0119 usuwalne tiolowe grupy pomocnicze i zmodyfikowane aminokwasy, kt\u00f3re na\u015bladuj\u0105 reaktywno\u015b\u0107 cysteiny i mo\u017cna je usun\u0105\u0107 po ligacji, dzi\u0119ki czemu pierwotna sekwencja zostaje zachowana.<\/p>\n
R\u00f3wnie krytyczne s\u0105 warunki reakcji. Bufor ligacyjny utrzymuje si\u0119 zwykle przy pH 7 i zawiera katalizator tiolowy, taki jak MPAA, kt\u00f3ry przyspiesza wymian\u0119 tioestr\u00f3w i zapobiega zatrzymaniu si\u0119 reakcji na etapie zwi\u0105zku po\u015bredniego. Tlen wyklucza si\u0119 w mo\u017cliwie najwi\u0119kszym stopniu, poniewa\u017c wolne grupy tiolowe uleg\u0142yby w przeciwnym razie utlenieniu do niepo\u017c\u0105danych mostk\u00f3w disiarczkowych, co obni\u017ca wydajno\u015b\u0107 ligacji. Po zako\u0144czeniu ligacji nast\u0119puje zwykle dodatkowy etap oczyszczania metod\u0105 preparatywnej RP-HPLC, kt\u00f3ry oddziela nieprzereagowany fragment od produktu ligacji.<\/p>\n
Natywna ligacja chemiczna otworzy\u0142a w chemii peptyd\u00f3w drog\u0119 do materia\u0142u badawczego niedost\u0119pnego klasyczn\u0105 metod\u0105 SPPS: d\u0142u\u017cszych \u0142a\u0144cuch\u00f3w syntetycznych, a nawet w pe\u0142ni syntetycznych ma\u0142ych bia\u0142ek, zbudowanych z fragment\u00f3w, z kt\u00f3rych ka\u017cdy mo\u017cna dobrze skontrolowa\u0107 i oczy\u015bci\u0107 osobno. Dla laboratori\u00f3w pracuj\u0105cych z tego rodzaju konstruktami oznacza to dodatkow\u0105 warstw\u0119 planowania \u2014 kt\u00f3re fragmenty, kt\u00f3re miejsca ligacji, jaka kolejno\u015b\u0107 \u2014 opr\u00f3cz syntezy i oczyszczania potrzebnych ju\u017c dla ka\u017cdego pojedynczego fragmentu.<\/p>\n
Niniejsze informacje s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Produkty i informacje Dutch Peptide Labs nie s\u0105 przeznaczone do stosowania u ludzi ani zwierz\u0105t, ani do zastosowa\u0144 diagnostycznych lub terapeutycznych.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Dlaczego SPPS nie skaluje si\u0119 w niesko\u0144czono\u015b\u0107 Synteza peptyd\u00f3w na fazie sta\u0142ej (SPPS) to standardowa metoda wytwarzania peptyd\u00f3w badawczych, reszta po reszcie, na sta\u0142ym no\u015bniku \u017cywicznym. We wcze\u015bniejszych artyku\u0142ach na tym blogu om\u00f3wili\u015bmy elementy sk\u0142adowe tego procesu: grupy ochronne, wyb\u00f3r \u017cywicy, odczynniki sprz\u0119gaj\u0105ce oraz odszczepienie, kt\u00f3re uwalnia surowy peptyd z \u017cywicy. W tym wszystkim pozostaje […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1401","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1401","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1401"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1401\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81947,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1401\/revisions\/81947"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1401"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1401"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1401"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}