Oznaczenie masy nienaruszonej cz\u0105steczki metod\u0105 LC-MS potwierdza, \u017ce peptyd badawczy ma prawid\u0142ow\u0105 mas\u0119 cz\u0105steczkow\u0105, ale niewiele m\u00f3wi o dok\u0142adnej kolejno\u015bci aminokwas\u00f3w w jego obr\u0119bie. Dwa peptydy o identycznej masie mog\u0105 mie\u0107 zupe\u0142nie r\u00f3\u017cne sekwencje wskutek zamiany reszt. Mapowanie peptydowe to technika, kt\u00f3ra pozwala dokona\u0107 tego rozr\u00f3\u017cnienia: dzieli peptyd na mniejsze, \u0142atwe do analizy fragmenty i w ten spos\u00f3b ustala pe\u0142n\u0105 sekwencj\u0119. W kontroli jako\u015bci peptyd\u00f3w badawczych stanowi cenne uzupe\u0142nienie analiz masy nienaruszonej cz\u0105steczki i czysto\u015bci.<\/p>\n
Spektrometr mas mierzy mas\u0119 cz\u0105steczkow\u0105 nienaruszonego peptydu z du\u017c\u0105 dok\u0142adno\u015bci\u0105, a w po\u0142\u0105czeniu z czasem retencji w RP-HPLC daje to mocn\u0105 przes\u0142ank\u0119 co do to\u017csamo\u015bci. Mimo to istniej\u0105 scenariusze, w kt\u00f3rych nie zapewnia to wystarczaj\u0105cej pewno\u015bci: izobaryczne podstawienia aminokwas\u00f3w (takie jak leucyna i izoleucyna, kt\u00f3re maj\u0105 dok\u0142adnie t\u0119 sam\u0105 mas\u0119), zamiany dw\u00f3ch reszt, kt\u00f3re razem daj\u0105 t\u0119 sam\u0105 mas\u0119 co inna para, lub delecja, kt\u00f3r\u0105 przypadkowo kompensuje inne odchylenie. W takich przypadkach masa nienaruszonej cz\u0105steczki nie wykazuje b\u0142\u0119du sekwencji, podczas gdy rzeczywista kolejno\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w r\u00f3\u017cni si\u0119 od zamierzonej sekwencji. Mapowanie peptydowe opracowano w\u0142a\u015bnie po to, aby wykrywa\u0107 tego rodzaju ukryte odchylenia, badaj\u0105c peptyd na poziomie sekwencji, a nie jako jedn\u0105 ca\u0142o\u015b\u0107.<\/p>\n
Pierwszym etapem mapowania peptydowego jest fragmentacja peptydu badawczego w przewidywalnych miejscach. Najcz\u0119\u015bciej stosowanym podej\u015bciem jest trawienie enzymatyczne proteazami, takimi jak trypsyna (tnie za lizyn\u0105 i arginin\u0105) lub Glu-C (tnie za kwasem glutaminowym), poniewa\u017c enzymy te tn\u0105 w spos\u00f3b wysoce specyficzny i powtarzalny. W przypadku peptyd\u00f3w, kt\u00f3re nie zawieraj\u0105 odpowiednich miejsc ci\u0119cia dla trypsyny lub Glu-C, albo przy ukierunkowanym wyja\u015bnianiu struktury stosuje si\u0119 czasem zamiast tego trawienie chemiczne, np. rozszczepienie bromocyjanem (CNBr) przy resztach metioniny. Wyb\u00f3r metody trawienia zale\u017cy w du\u017cym stopniu od sk\u0142adu aminokwasowego konkretnego peptydu badawczego: sekwencja bez lizyny i argininy wymaga innego enzymu lub drogi chemicznej ni\u017c peptyd bogaty w lizyn\u0119.<\/p>\n
Po trawieniu mieszanin\u0119 fragment\u00f3w rozdziela si\u0119 metod\u0105 chromatografii HPLC w odwr\u00f3conym uk\u0142adzie faz sprz\u0119\u017conej z tandemow\u0105 spektrometri\u0105 mas (LC-MS\/MS). Ka\u017cdy fragment jest najpierw wa\u017cony (MS1), a nast\u0119pnie dalej fragmentowany w aparacie (MS2), przy czym powsta\u0142e fragmenty zderzeniowe ujawniaj\u0105 kolejno\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w w danym odcinku peptydu. Por\u00f3wnuj\u0105c zmierzone masy fragment\u00f3w z teoretycznie oczekiwanymi fragmentami zamierzonej sekwencji, uzyskuje si\u0119 \u201epokrycie sekwencji\u201d: odsetek sekwencji, kt\u00f3ry rzeczywi\u015bcie potwierdzono do\u015bwiadczalnie. Pe\u0142ne lub prawie pe\u0142ne pokrycie daje znacznie wi\u0119ksz\u0105 pewno\u015b\u0107 co do integralno\u015bci sekwencji ni\u017c sam pojedynczy pomiar masy nienaruszonej cz\u0105steczki.<\/p>\n
W kontek\u015bcie kontroli jako\u015bci peptyd\u00f3w badawczych mapowanie peptydowe stosuje si\u0119 g\u0142\u00f3wnie jako ortogonalne potwierdzenie obok typowego po\u0142\u0105czenia oznaczenia czysto\u015bci metod\u0105 RP-HPLC i spektrometrii mas nienaruszonej cz\u0105steczki, zw\u0142aszcza w przypadku d\u0142u\u017cszych sekwencji, peptyd\u00f3w z kilkoma zmodyfikowanymi resztami lub gdy wcze\u015bniejsze analizy da\u0142y niejednoznaczny wynik. Opublikowana literatura metodyczna opisuje mapowanie peptydowe z trawieniem chemicznym i MALDI-MS jako ugruntowane podej\u015bcie do potwierdzania sekwencji w charakterystyce bia\u0142ek i peptyd\u00f3w, a te same zasady maj\u0105 zastosowanie do syntetycznych peptyd\u00f3w badawczych. Przy rutynowym zwalnianiu partii metoda ta jest bardziej pracoch\u0142onna ni\u017c standardowa kontrola certyfikatu CoA, dlatego cz\u0119\u015bciej zarezerwowana jest dla ukierunkowanego potwierdzania to\u017csamo\u015bci, ni\u017c stosowana dla ka\u017cdej wyprodukowanej partii.<\/p>\n
Niepe\u0142ne pokrycie sekwencji nie oznacza automatycznie b\u0142\u0119du sekwencji: niekt\u00f3re fragmenty s\u0105 zbyt ma\u0142e lub zbyt hydrofilowe, aby by\u0142y dobrze zatrzymywane na kolumnie HPLC, i mog\u0105 w zwi\u0105zku z tym zosta\u0107 utracone, zanim dotr\u0105 do spektrometru mas. Badacze, kt\u00f3rzy stosuj\u0105 mapowanie peptydowe lub zlecaj\u0105 jego wykonanie, uwzgl\u0119dniaj\u0105 to, dostosowuj\u0105c strategi\u0119 trawienia do konkretnej sekwencji i \u0142\u0105cz\u0105c kilka enzym\u00f3w, gdy jeden enzym daje niewystarczaj\u0105ce pokrycie. Pozwala to uzyska\u0107 pe\u0142niejszy i bardziej wiarygodny obraz rzeczywistej kolejno\u015bci aminokwas\u00f3w w materiale badawczym.<\/p>\n
Produkty i informacje zamieszczone na tej stronie internetowej s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, ani do zastosowa\u0144 diagnostycznych lub terapeutycznych.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Oznaczenie masy nienaruszonej cz\u0105steczki metod\u0105 LC-MS potwierdza, \u017ce peptyd badawczy ma prawid\u0142ow\u0105 mas\u0119 cz\u0105steczkow\u0105, ale niewiele m\u00f3wi o dok\u0142adnej kolejno\u015bci aminokwas\u00f3w w jego obr\u0119bie. Dwa peptydy o identycznej masie mog\u0105 mie\u0107 zupe\u0142nie r\u00f3\u017cne sekwencje wskutek zamiany reszt. Mapowanie peptydowe to technika, kt\u00f3ra pozwala dokona\u0107 tego rozr\u00f3\u017cnienia: dzieli peptyd na mniejsze, \u0142atwe do analizy fragmenty i […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1405","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1405","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1405"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1405\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81953,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1405\/revisions\/81953"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1405"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1405"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1405"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}