Po etapie odszczepiania na stole laboratoryjnym nie ma czystego peptydu badawczego, lecz z\u0142o\u017cona surowa mieszanina. W poprzednim artykule z tej serii om\u00f3wili\u015bmy, w jaki spos\u00f3b zmiatacze stosowane podczas odszczepiania za pomoc\u0105 TFA zapobiegaj\u0105 uszkodzeniu peptydu przez reaktywne karbokationy. Kolejny etap procesu jest co najmniej r\u00f3wnie decyduj\u0105cy dla ostatecznej jako\u015bci: oczyszczanie metod\u0105 preparatywnej HPLC. W tym artykule opisujemy, jak laboratoria badawcze przekszta\u0142caj\u0105 surow\u0105 mieszanin\u0119 po syntezie w okre\u015blon\u0105, czyst\u0105 frakcj\u0119 peptydu.<\/p>\n
Surowy roztw\u00f3r peptydu po odszczepieniu i wytr\u0105ceniu rzadko zawiera wy\u0142\u0105cznie sekwencj\u0119 docelow\u0105. Opr\u00f3cz po\u017c\u0105danego peptydu w mieszaninie znajduj\u0105 si\u0119 zwykle sekwencje delecyjne (powsta\u0142e wskutek pomini\u0119tych sprz\u0119ga\u0144, jak om\u00f3wili\u015bmy wcze\u015bniej przy okazji cappingu), sekwencje skr\u00f3cone, warianty utlenione lub zracemizowane, pozosta\u0142o\u015bci grup ochronnych oraz produkty uboczne zmiataczy. Poniewa\u017c wiele z tych zanieczyszcze\u0144 jest chemicznie bardzo podobnych do peptydu docelowego, prosta filtracja lub ekstrakcja nie wystarcza. Typowym podej\u015bciem w warunkach badawczych jest rozdzia\u0142 chromatograficzny oparty na niewielkich r\u00f3\u017cnicach hydrofobowo\u015bci.<\/p>\n
Preparatywne oczyszczanie peptyd\u00f3w badawczych prowadzi si\u0119 przewa\u017cnie metod\u0105 HPLC w odwr\u00f3conym uk\u0142adzie faz na kolumnie C18. Faz\u0119 ruchom\u0105 stanowi mieszanina wody i acetonitrylu z niewielk\u0105 ilo\u015bci\u0105 kwasu trifluorooctowego jako odczynnika par jonowych. W miar\u0119 wzrostu udzia\u0142u acetonitrylu w gradiencie peptydy eluuj\u0105 w kolejno\u015bci rosn\u0105cej hydrofobowo\u015bci. Peptyd docelowy i blisko spokrewnione zanieczyszczenia cz\u0119sto pojawiaj\u0105 si\u0119 jako s\u0105siednie, cz\u0119\u015bciowo nak\u0142adaj\u0105ce si\u0119 piki, co sprawia, \u017ce wyb\u00f3r nachylenia gradientu i chemii kolumny jest krytycznym parametrem badawczym.<\/p>\n
Opracowanie metody niemal zawsze zaczyna si\u0119 w skali analitycznej: ma\u0142a kolumna, niskie obci\u0105\u017cenie, ostro zarysowane piki. Aby odtworzy\u0107 ten sam rozdzia\u0142 w wi\u0119kszej skali, laboratoria stosuj\u0105 regu\u0142y przenoszenia skali, kt\u00f3re wi\u0105\u017c\u0105 ze sob\u0105 \u015brednic\u0119 kolumny, d\u0142ugo\u015b\u0107 kolumny, obci\u0105\u017cenie pr\u00f3bk\u0105 i nat\u0119\u017cenie przep\u0142ywu. Zgodnie z regu\u0142\u0105 praktyczn\u0105 obci\u0105\u017cenie na gram fazy stacjonarnej pozostaje mniej wi\u0119cej sta\u0142e, natomiast nat\u0119\u017cenie przep\u0142ywu ro\u015bnie proporcjonalnie do pola przekroju poprzecznego kolumny. Je\u015bli ta proporcja nie jest zachowana, rozdzielczo\u015b\u0107 si\u0119 pogarsza, a piki, kt\u00f3re w skali analitycznej by\u0142y jeszcze rozdzielone, zaczynaj\u0105 si\u0119 nak\u0142ada\u0107.<\/p>\n
Podczas rozdzia\u0142u preparatywnego frakcje zbiera si\u0119 na podstawie detekcji UV, zwykle przy 214 lub 280 nm. Ka\u017cd\u0105 frakcj\u0119 sprawdza si\u0119 nast\u0119pnie metod\u0105 analitycznej HPLC, a w warunkach badawczych cz\u0119sto r\u00f3wnie\u017c spektrometri\u0105 mas, aby potwierdzi\u0107 obecno\u015b\u0107 prawid\u0142owej masy i upewni\u0107 si\u0119, \u017ce w piku nie wyst\u0119puje \u017cadne koeluuj\u0105ce zanieczyszczenie. \u0141\u0105czy si\u0119 wy\u0142\u0105cznie frakcje spe\u0142niaj\u0105ce wcze\u015bniej okre\u015blony pr\u00f3g czysto\u015bci. To po\u0142\u0105czenie rozdzia\u0142u chromatograficznego i weryfikacji analitycznej jest powodem, dla kt\u00f3rego certyfikat analizy peptyd\u00f3w badawczych wydaje si\u0119 zwykle na poziomie partii, jak opisali\u015bmy wcze\u015bniej w artykule o certyfikatach CoA dla poszczeg\u00f3lnych partii.<\/p>\n
Po\u0142\u0105czone frakcje nadal zawieraj\u0105 znaczne ilo\u015bci wody, acetonitrylu i TFA. Zanim oczyszczony materia\u0142 badawczy b\u0119dzie nadawa\u0142 si\u0119 do przechowywania, acetonitryl usuwa si\u0119 zwykle pod pr\u00f3\u017cni\u0105, po czym nast\u0119puje liofilizacja \u2014 etap suszenia sublimacyjnego om\u00f3wiony we wcze\u015bniejszym artykule z tej serii. W efekcie powstaje stabilny, scharakteryzowany analitycznie proszek, kt\u00f3ry stanowi punkt wyj\u015bcia do dalszych bada\u0144 laboratoryjnych.<\/p>\n
Te produkty i informacje s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, do cel\u00f3w diagnostycznych ani do zastosowa\u0144 terapeutycznych.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Po etapie odszczepiania na stole laboratoryjnym nie ma czystego peptydu badawczego, lecz z\u0142o\u017cona surowa mieszanina. W poprzednim artykule z tej serii om\u00f3wili\u015bmy, w jaki spos\u00f3b zmiatacze stosowane podczas odszczepiania za pomoc\u0105 TFA zapobiegaj\u0105 uszkodzeniu peptydu przez reaktywne karbokationy. Kolejny etap procesu jest co najmniej r\u00f3wnie decyduj\u0105cy dla ostatecznej jako\u015bci: oczyszczanie metod\u0105 preparatywnej HPLC. W tym […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1408","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1408","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1408"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1408\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81956,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1408\/revisions\/81956"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1408"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1408"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1408"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}