Kwas trifluorooctowy (TFA) jest niezb\u0119dny w preparatywnym oczyszczaniu peptyd\u00f3w badawczych metod\u0105 HPLC: dzia\u0142a jako odczynnik tworz\u0105cy pary jonowe i daje podczas oczyszczania ostre, dobrze rozdzielone piki. Po wymianie przeciwjonu \u2014 b\u0119d\u0105cej tematem wcze\u015bniejszego artyku\u0142u na tym blogu \u2014 wi\u0119kszo\u015b\u0107 TFA zostaje zast\u0105piona octanem lub chlorkiem. Mimo to niemal zawsze pozostaje \u015blad jon\u00f3w trifluorooctanowych zwi\u0105zanych z zasadowymi \u0142a\u0144cuchami bocznymi peptydu.<\/p>\n
Do cel\u00f3w badawczych t\u0119 pozosta\u0142o\u015b\u0107 warto udokumentowa\u0107. Trifluorooctan mo\u017ce wp\u0142ywa\u0107 na sygna\u0142y analityczne, zak\u0142\u00f3ca niekt\u00f3re uk\u0142ady kultur kom\u00f3rkowych in vitro i wlicza si\u0119 do bilansu masy partii. Laboratoria stosuj\u0105ce peptydy w czu\u0142ych uk\u0142adach testowych chc\u0105 zatem wiedzie\u0107 dok\u0142adnie, ile TFA jest jeszcze obecne, a nie jedynie tyle, \u017ce wymiana \u201ew du\u017cej mierze\u201d si\u0119 uda\u0142a.<\/p>\n
Chromatografia jonowa (IC) jest najcz\u0119\u015bciej stosowan\u0105 technik\u0105 oznaczania ilo\u015bciowego jon\u00f3w trifluorooctanowych po wymianie przeciwjonu. Zasada jest por\u00f3wnywalna z HPLC, ale dostosowana specjalnie do zwi\u0105zk\u00f3w jonowych: pr\u00f3bk\u0119 przepuszcza si\u0119 przez kolumn\u0119 do wymiany anion\u00f3w, po czym trifluorooctan zostaje rozdzielony od innych anion\u00f3w, takich jak octan, chlorek i w\u0119glan, na podstawie ich powinowactwa do fazy stacjonarnej.<\/p>\n
Detekcja odbywa si\u0119 zwykle przez detekcj\u0119 konduktometryczn\u0105 po chemicznej supresji (detekcja konduktometryczna z supresj\u0105). Ten etap supresji obni\u017ca przewodno\u015b\u0107 t\u0142a eluentu, tak aby niewielkie sygna\u0142y jon\u00f3w trifluorooctanowych sta\u0142y si\u0119 wyra\u017anie widoczne ponad szumem. W przypadku pr\u00f3bek peptydowych o niskiej zawarto\u015bci TFA taka czu\u0142o\u015b\u0107 jest konieczna: st\u0119\u017cenia w dolnym zakresie ppm musz\u0105 by\u0107 wiarygodnie odr\u00f3\u017cnialne od szumu pomiarowego.<\/p>\n
Chromatografia jonowa nie jest jedyn\u0105 drog\u0105 do uzyskania tej warto\u015bci. Niekt\u00f3re laboratoria stosuj\u0105 zamiast niej spektroskopi\u0119 19<\/sup>F-NMR, ca\u0142kuj\u0105c sygna\u0142 fluoru trifluorooctanu bezpo\u015brednio wobec wzorca wewn\u0119trznego, albo HPLC z detektorem aerozolu na\u0142adowanego typu corona (CAD), kt\u00f3ry uwidacznia tak\u017ce jony nieaktywne w UV. Ka\u017cda metoda ma inn\u0105 czu\u0142o\u015b\u0107 i inny profil b\u0142\u0119d\u00f3w, co wyja\u015bnia, dlaczego niekt\u00f3rzy dostawcy raportuj\u0105 dla krytycznych partii kilka technik obok siebie.<\/p>\n Procedura rozpoczyna si\u0119 rozpuszczeniem odwa\u017conej ilo\u015bci liofilizowanego peptydu w wodzie, po czym nast\u0119puje rozcie\u0144czenie do zakresu liniowego krzywej kalibracyjnej. Krzyw\u0105 t\u0119 buduje si\u0119 z wzorc\u00f3w trifluorooctanu o znanym st\u0119\u017ceniu, tak aby powierzchni\u0119 piku pr\u00f3bki mo\u017cna by\u0142o przeliczy\u0107 na st\u0119\u017cenie.<\/p>\n Istotne zagadnienia w tej analizie to wyznaczenie granicy oznaczalno\u015bci (LOQ), powtarzalno\u015b\u0107 nastrzyk\u00f3w i mo\u017cliwe efekty matrycowe pochodz\u0105ce od samego peptydu. Poniewa\u017c peptyd tworzy z\u0142o\u017con\u0105 matryc\u0119 t\u0142a, cz\u0119sto stosuje si\u0119 metod\u0119 dodatku wzorca, aby sprawdzi\u0107, czy inne sk\u0142adniki pr\u00f3bki nie zak\u0142\u00f3caj\u0105 pomiaru.<\/p>\n Wynik wyra\u017ca si\u0119 zwykle jako procent masowy (% m\/m) trifluorooctanu w stosunku do ca\u0142kowitej masy peptydu albo jako liczb\u0119 cz\u0105steczek TFA na cz\u0105steczk\u0119 peptydu, gdy stechiometria ma znaczenie dla zastosowania. Niska pozosta\u0142o\u015b\u0107 po wymianie potwierdza, \u017ce proces odsalania i wymiany by\u0142 skuteczny; nieoczekiwanie wysoka zawarto\u015b\u0107 wskazuje na niepe\u0142ny etap wymiany lub na niedostateczne przemywanie podczas obr\u00f3bki ko\u0144cowej.<\/p>\n Warto\u015bci te zestawia si\u0119 zwykle z wynikami czysto\u015bci RP-HPLC i potwierdzenia to\u017csamo\u015bci metod\u0105 spektrometrii mas. Razem daj\u0105 one pe\u0142niejszy obraz partii ni\u017c sama czysto\u015b\u0107: peptyd mo\u017ce wygl\u0105da\u0107 na chromatograficznie czysty, podczas gdy pozosta\u0142o\u015b\u0107 przeciwjonu jest nadal znacz\u0105ca, po prostu dlatego, \u017ce ma\u0142e jony wykazuj\u0105 inne zachowanie retencyjne ni\u017c sam peptyd.<\/p>\n Dla grup badawczych stosuj\u0105cych peptydy w czu\u0142ych testach pozosta\u0142o\u015b\u0107 TFA jest jedn\u0105 z danych, kt\u00f3re wraz z numerem partii, procentem czysto\u015bci i widmem mas powinny znale\u017a\u0107 si\u0119 w certyfikacie analizy w\u0142a\u015bciwym dla danej partii. Bez tego wpisu pozostaje niejasne, czy odbiegaj\u0105cy pomiar w eksperymencie nale\u017cy przypisa\u0107 samemu peptydowi, czy pozosta\u0142ym w pr\u00f3bce przeciwjonom. Chromatografia jonowa dostarcza wi\u0119c nie estetycznego szczeg\u00f3\u0142u, lecz konkretnej warto\u015bci, kt\u00f3ra s\u0142u\u017cy identyfikowalno\u015bci i powtarzalno\u015bci bada\u0144.<\/p>\n Informacje zawarte w tym artykule oraz produkty Dutch Peptide Labs s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi ani zwierz\u0119ta, do zastosowa\u0144 diagnostycznych ani do stosowania terapeutycznego.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Dlaczego pozosta\u0142o\u015b\u0107 TFA ma znaczenie Kwas trifluorooctowy (TFA) jest niezb\u0119dny w preparatywnym oczyszczaniu peptyd\u00f3w badawczych metod\u0105 HPLC: dzia\u0142a jako odczynnik tworz\u0105cy pary jonowe i daje podczas oczyszczania ostre, dobrze rozdzielone piki. Po wymianie przeciwjonu \u2014 b\u0119d\u0105cej tematem wcze\u015bniejszego artyku\u0142u na tym blogu \u2014 wi\u0119kszo\u015b\u0107 TFA zostaje zast\u0105piona octanem lub chlorkiem. Mimo to niemal zawsze pozostaje […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1410","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1410","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1410"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1410\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81959,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1410\/revisions\/81959"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1410"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1410"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1410"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}Od pr\u00f3bki do wyniku<\/h2>\n
Interpretacja wynik\u00f3w<\/h2>\n
Miejsce w dokumentacji<\/h2>\n