Preparatywna chromatografia HPLC daje seri\u0119 frakcji, z kt\u00f3rych ka\u017cda ma w\u0142asny profil czysto\u015bci. Frakcja opuszczaj\u0105ca kolektor nie jest jednak jeszcze produktem ko\u0144cowym. Mi\u0119dzy \u201eczystym pikiem\u201d a \u201eudokumentowanym peptydem badawczym w postaci proszku\u201d le\u017c\u0105 dwa etapy, kt\u00f3re wiele tekst\u00f3w wprowadzaj\u0105cych pomija: decyzja, kt\u00f3re frakcje mo\u017cna po\u0142\u0105czy\u0107, oraz wymiana lub usuni\u0119cie przeciwjonu pozosta\u0142ego po syntezie peptydu. Ten artyku\u0142 omawia oba etapy jako logiczn\u0105 kontynuacj\u0119 procesu oczyszczania.<\/p>\n
Po ka\u017cdym przebiegu ka\u017cda frakcja jest analizowana oddzielnie, zwykle za pomoc\u0105 analitycznej chromatografii HPLC i spektrometrii mas. Tylko frakcje spe\u0142niaj\u0105ce z g\u00f3ry okre\u015blone kryterium czysto\u015bci \u2014 w praktyce cz\u0119sto czysto\u015b\u0107 piku powy\u017cej 98% bez istotnych s\u0105siednich pik\u00f3w \u2014 kwalifikuj\u0105 si\u0119 do po\u0142\u0105czenia w jedn\u0105 pul\u0119. Frakcje tu\u017c poni\u017cej tej granicy lub frakcje, w kt\u00f3rych rami\u0119 piku nak\u0142ada si\u0119 na pik g\u0142\u00f3wny, s\u0105 odk\u0142adane lub odrzucane.<\/p>\n
Wyb\u00f3r ten jest kwesti\u0105 r\u00f3wnowagi: zbyt rygorystyczne \u0142\u0105czenie daje mniejsz\u0105 wydajno\u015b\u0107, zbyt szerokie \u0142\u0105czenie obni\u017ca czysto\u015b\u0107 ostatecznej partii. Zespo\u0142y badawcze zapisuj\u0105 zastosowane granice oraz uzasadnienie w\u0142\u0105czenia lub wykluczenia ka\u017cdej frakcji, tak aby sk\u0142ad puli pozosta\u0142 identyfikowalny a\u017c do poziomu pojedynczej frakcji.<\/p>\n
Peptydy budowane metod\u0105 syntezy na fazie sta\u0142ej Fmoc s\u0105 zwykle izolowane po odszczepieniu jako s\u00f3l trifluorooctanowa (TFA): eluent w preparatywnym przebiegu HPLC zawiera TFA jako odczynnik par jonowych, a kwas ten pozostaje zwi\u0105zany ze szkieletem peptydu. W niekt\u00f3rych zastosowaniach badawczych nie stanowi to problemu, ale TFA mo\u017ce zak\u0142\u00f3ca\u0107 niekt\u00f3re oznaczenia lub wp\u0142ywa\u0107 na w\u0142a\u015bciwo\u015bci fizykochemiczne pr\u00f3bki. Z tego powodu laboratoria decyduj\u0105 si\u0119 czasem na zast\u0105pienie przeciwjonu octanem lub chlorkiem, kt\u00f3re maj\u0105 korzystniejszy profil interferencji w dalszych analizach.<\/p>\n
Istnieje kilka sposob\u00f3w wymiany przeciwjonu. Powszechnie stosowan\u0105 metod\u0105 jest wielokrotna liofilizacja z rozcie\u0144czonego kwasu odpowiadaj\u0105cego po\u017c\u0105danemu przeciwjonowi, na przyk\u0142ad kwasu octowego, przy kt\u00f3rej TFA jest stopniowo zast\u0119powany w powtarzanych cyklach rozpuszczania i odparowywania. Alternatywna droga prowadzi przez \u017cywic\u0119 jonowymienn\u0105: pr\u00f3bk\u0119 przepuszcza si\u0119 przez kolumn\u0119 zawieraj\u0105c\u0105 po\u017c\u0105dany przeciwjon, co powoduje wymian\u0119 TFA, podczas gdy peptyd \u2014 w zale\u017cno\u015bci od wybranego protoko\u0142u \u2014 wi\u0105\u017ce si\u0119 z matryc\u0105 lub przez ni\u0105 przechodzi. Obie drogi wymagaj\u0105 p\u00f3\u017aniejszej kontroli \u2014 zwykle ponownie analitycznej chromatografii HPLC lub chromatografii jonowej \u2014 aby potwierdzi\u0107, \u017ce wymiana przeciwjonu zosta\u0142a przeprowadzona ca\u0142kowicie i \u017ce nie pozosta\u0142o zanieczyszczenie krzy\u017cowe poprzednim przeciwjonem.<\/p>\n
Opr\u00f3cz wymiany przeciwjonu pr\u00f3bk\u0119 cz\u0119sto trzeba jeszcze odsoli\u0107: sole buforowe i inne nielotne sk\u0142adniki fazy ruchomej musz\u0105 zosta\u0107 usuni\u0119te, zanim pr\u00f3bka b\u0119dzie nadawa\u0107 si\u0119 do czu\u0142ych technik, takich jak LC-MS. Powszechnym podej\u015bciem jest ekstrakcja do fazy sta\u0142ej w uk\u0142adzie faz odwr\u00f3conych, zazwyczaj na materiale C18: peptyd wi\u0105\u017ce si\u0119 z sorbentem, podczas gdy sole s\u0105 wyp\u0142ukiwane faz\u0105 wodn\u0105, po czym peptyd jest eluowany rozpuszczalnikiem organicznym. Dlatego te\u017c \u201eczysty wed\u0142ug HPLC\u201d i \u201eodpowiedni do spektrometrii mas\u201d to dwa r\u00f3\u017cne kryteria jako\u015bci \u2014 frakcja mo\u017ce by\u0107 doskona\u0142a pod wzgl\u0119dem czysto\u015bci peptydu, a mimo to zawiera\u0107 pozosta\u0142o\u015b\u0107 soli zak\u0142\u00f3caj\u0105c\u0105 analiz\u0119 MS.<\/p>\n
Po skompletowaniu puli, ustaleniu lub wymianie przeciwjonu i usuni\u0119ciu soli nast\u0119puje liofilizacja do stabilnego proszku \u2014 temat wcze\u015bniejszych analiz na tym blogu, dotycz\u0105cych suszenia sublimacyjnego i zawarto\u015bci wilgoci resztkowej. Ka\u017cdy etap tego \u0142a\u0144cucha (wyb\u00f3r frakcji, status przeciwjonu, metoda odsalania) powinien znale\u017a\u0107 si\u0119 w dokumentacji analitycznej partii, obok zwyk\u0142ych danych z CoA. Dzi\u0119ki temu pochodzenie pr\u00f3bki badawczej pozostaje w pe\u0142ni mo\u017cliwe do odtworzenia \u2014 od przebiegu HPLC a\u017c po ko\u0144cowy proszek.<\/p>\n
Produkty i informacje na tej stronie internetowej s\u0105 przeznaczone wy\u0142\u0105cznie do cel\u00f3w laboratoryjnych i badawczych. Nie s\u0105 przeznaczone do spo\u017cycia przez ludzi lub zwierz\u0119ta ani do u\u017cytku diagnostycznego lub terapeutycznego.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Preparatywna chromatografia HPLC daje seri\u0119 frakcji, z kt\u00f3rych ka\u017cda ma w\u0142asny profil czysto\u015bci. Frakcja opuszczaj\u0105ca kolektor nie jest jednak jeszcze produktem ko\u0144cowym. Mi\u0119dzy \u201eczystym pikiem\u201d a \u201eudokumentowanym peptydem badawczym w postaci proszku\u201d le\u017c\u0105 dwa etapy, kt\u00f3re wiele tekst\u00f3w wprowadzaj\u0105cych pomija: decyzja, kt\u00f3re frakcje mo\u017cna po\u0142\u0105czy\u0107, oraz wymiana lub usuni\u0119cie przeciwjonu pozosta\u0142ego po syntezie peptydu. Ten […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[265],"tags":[],"class_list":["post-1420","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-uncategorized-pl"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1420","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1420"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1420\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":81973,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1420\/revisions\/81973"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1420"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1420"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dutchpeptidelabs.nl\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1420"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}