Każdy, kto pracuje w laboratorium z roztworami peptydów, zna ten problem: przygotowuje się zrekonstytuowany roztwór podstawowy, część zużywa się do eksperymentu, a resztę odkłada z powrotem do zamrażarki. Następnym razem ta sama fiolka jest ponownie rozmrażana, używana i znowu zamrażana. Każdy taki cykl kosztuje stabilność. Porcjowanie (alikwotowanie) – podzielenie roztworu na małe, jednorazowe porcje bezpośrednio po rekonstytucji – to jeden z najprostszych sposobów, aby temu zapobiec, a mimo to w praktyce często się go pomija.

Co dzieje się podczas cyklu zamrażania-rozmrażania

Gdy roztwór wodny zamarza, powstają kryształy lodu. W miarę wykrystalizowywania się wody stężenie substancji rozpuszczonych w pozostałej fazie ciekłej rośnie – efekt ten nazywa się kryozatężeniem. Dla peptydu oznacza to lokalnie znacznie wyższe stężenie niż wartość nominalna, co może sprzyjać agregacji i wytrącaniu. Podczas rozmrażania sytuacja się odwraca, ale nie zawsze całkowicie: powstałe agregaty niekoniecznie ponownie się rozpuszczają. Po kilkukrotnym powtórzeniu tego procesu skumulowane uszkodzenia struktury peptydu mogą narastać w mierzalny sposób, co widać jako odbiegające piki HPLC lub spadającą intensywność sygnału w spektrometrii mas.

Rolę odgrywają również naprężenia mechaniczne: wzrost kryształów lodu może fizycznie uszkadzać wiązania peptydowe na granicy faz lód-ciecz, zwłaszcza w dłuższych lub wolniejszych cyklach zamrażania.

Dlaczego jedna fiolka i wiele cykli rozmrażania to zły pomysł

Efekt wielokrotnego zamrażania i rozmrażania nie jest liniowy. Pierwszy cykl często wykazuje niewielką mierzalną różnicę, ale od trzeciego lub czwartego cyklu degradacja wielu sekwencji peptydowych wyraźnie narasta, zwłaszcza w przypadku peptydów wrażliwych na utlenianie lub deamidację. Ponieważ efekt ten różni się w zależności od sekwencji i warunków buforowych, ryzyko jest trudne do przewidzenia bez specjalnego badania – a większość laboratoriów nie ma na to ani czasu, ani budżetu. Porcjowanie w dużej mierze eliminuje tę niepewność: każda probówka jest rozmrażana tylko raz i nigdy ponownie nie zamrażana.

Opracowanie strategii porcjowania

Praktyczne podejście zaczyna się bezpośrednio po rekonstytucji, a nie w chwili pierwszego ponownego użycia:

• Z góry ustalić objętość na eksperyment. Należy wyjść od typowego zużycia na sesję, z niewielkim zapasem, tak aby pozostawała jak najmniejsza objętość resztkowa.
• Używać małych probówek o niskiej adsorpcji (low-binding). Przy małych objętościach adsorpcja na ściankach standardowych probówek polipropylenowych może zatrzymać stosunkowo dużą część masy peptydu; probówki o niskim wiązaniu białek ograniczają tę stratę.
• Każdą probówkę opisać w pełni. Nazwa peptydu, stężenie, bufor, data rekonstytucji i numer partii powinny znaleźć się na każdej probówce, a nie tylko na oryginalnej fiolce.
• Zamrażać szybko. Szybkie zamrażanie (na przykład w łaźni etanol/suchy lód lub w -80 °C) ogranicza tworzenie się dużych kryształów lodu w porównaniu z powolnym zamrażaniem w standardowej zamrażarce -20 °C.
• Rejestrować użycie każdej porcji. Po rozmrożeniu probówka jest oznaczana jako zużyta i nie jest ponownie zamrażana – nawet jeśli pozostała w niej niewielka reszta.

Temperatura przechowywania i trwałość porcji

W przypadku większości peptydów badawczych w roztworze obowiązuje zasada: im zimniej, tym większa stabilność długoterminowa, przy czym do długotrwałego przechowywania preferowana jest temperatura -80 °C zamiast -20 °C. Na krótki okres (od kilku dni do kilku tygodni, zależnie od sekwencji i buforu) wystarczyć może zamrażarka -20 °C, pod warunkiem unikania cykli zamrażania-rozmrażania. Liofilizacja materiału wyjściowego, a następnie rekonstytucja tylko potrzebnej objętości tuż przed użyciem, jest w wielu zastosowaniach jeszcze stabilniejsza niż przechowywanie dużego zapasu roztworu – zob. także nasz wcześniejszy przewodnik po liofilizacji, w którym omówiono związane z tym kompromisy.

Koszty a ryzyko

Porcjowanie wymaga większej liczby probówek, więcej pracy przy opisywaniu i nieco więcej miejsca w zamrażarce. Wobec tych kosztów stoi pewność, że każdy eksperyment rozpoczyna się od materiału o spójnej jakości, bez niepewności związanej z fiolką rozmrażaną już cztery lub pięć razy. W analizach ilościowych, w których liczy się powtarzalność, ta różnica zwykle z nawiązką rekompensuje dodatkowy czas przygotowania.

Produkty i informacje Dutch Peptide Labs są przeznaczone wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych. Nie są przeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do zastosowań diagnostycznych ani terapeutycznych.