Dlaczego SPPS nie skaluje się w nieskończoność
Synteza peptydów na fazie stałej (SPPS) to standardowa metoda wytwarzania peptydów badawczych, reszta po reszcie, na stałym nośniku żywicznym. We wcześniejszych artykułach na tym blogu omówiliśmy elementy składowe tego procesu: grupy ochronne, wybór żywicy, odczynniki sprzęgające oraz odszczepienie, które uwalnia surowy peptyd z żywicy. W tym wszystkim pozostaje jednak niewypowiedziane, że SPPS ma praktyczną granicę długości. W miarę wydłużania się łańcucha kumulują się niepełne sprzęgania, sekwencje delecyjne i agregacja rosnącego łańcucha peptydowego na żywicy. Powyżej około 50 aminokwasów szansa na jednorodny produkt końcowy staje się statystycznie coraz mniejsza, nawet przy zoptymalizowanym protokole.
W badaniach dłuższych peptydów badawczych i małych białek jest to realne wąskie gardło. Rozwiązaniem opracowanym w literaturze nie jest jedna dłuższa synteza, lecz chemiczne łączenie kilku krótszych fragmentów, z których każdy wytwarza się metodą SPPS. Najczęściej stosowaną techniką jest natywna ligacja chemiczna (NCL).
Zasada natywnej ligacji chemicznej
NCL, pierwotnie opisana przez grupę badawczą Stephena Kenta w latach 90. XX wieku, wykorzystuje dwa niezabezpieczone fragmenty peptydowe, które reagują ze sobą chemoselektywnie w buforze wodnym przy obojętnym pH. Jeden fragment ma tioester na C-końcu, drugi wolną cysteinę na N-końcu. Ponieważ oba fragmenty są całkowicie niezabezpieczone, po samej ligacji nie jest potrzebny osobny etap deprotekcji, co znacznie upraszcza proces w porównaniu z klasyczną kondensacją fragmentów.
Reakcja przebiega w dwóch etapach. Najpierw zachodzi transtioestryfikacja: grupa tiolowa cysteiny atakuje tioester i tworzy nowy, przejściowy tioestrowy związek pośredni w miejscu ligacji. Ten związek pośredni ulega następnie wewnątrzcząsteczkowemu przegrupowaniu acylowemu S→N, w którym grupa acylowa migruje z atomu siarki do grupy aminowej tej samej cysteiny. W efekcie powstaje natywne wiązanie amidowe — chemicznie nieodróżnialne od wiązania peptydowego utworzonego podczas zwykłego sprzęgania w SPPS.
Od dwóch fragmentów do dłuższego łańcucha badawczego
Każdy fragment syntetyzuje się i oczyszcza osobno standardową metodą Fmoc-SPPS, dokładnie tak, jak opisaliśmy to wcześniej na tym blogu w odniesieniu do krótszych peptydów. Fragment C-końcowy przekształca się w tioester w trakcie syntezy lub po niej, natomiast N-końcowy fragment kolejnego segmentu wymaga cysteiny w pierwszej pozycji. W przypadku celów badawczych wykraczających poza to, co mogą objąć dwa fragmenty (białka docelowe liczące od około stu do dwustu pięćdziesięciu aminokwasów), przeprowadza się kilka ligacji jedna po drugiej (sekwencyjnie) lub wychodząc od fragmentu centralnego (konwergentnie). Wymaga to ścisłej kolejności etapów deprotekcji i ligacji, ponieważ każdy fragment może działać jako reaktywny partner tylko raz, zanim nastąpi kolejne sprzęganie.
Ograniczenia praktyczne w pracy badawczej
Największym praktycznym ograniczeniem klasycznej NCL jest wymóg obecności cysteiny w każdym miejscu ligacji. Nie każda sekwencja badawcza ma w tym miejscu naturalnie cysteinę, a wprowadzenie dodatkowej cysteiny może zmienić właściwości badanego obiektu. Dlatego w literaturze opisuje się usuwalne tiolowe grupy pomocnicze i zmodyfikowane aminokwasy, które naśladują reaktywność cysteiny i można je usunąć po ligacji, dzięki czemu pierwotna sekwencja zostaje zachowana.
Równie krytyczne są warunki reakcji. Bufor ligacyjny utrzymuje się zwykle przy pH 7 i zawiera katalizator tiolowy, taki jak MPAA, który przyspiesza wymianę tioestrów i zapobiega zatrzymaniu się reakcji na etapie związku pośredniego. Tlen wyklucza się w możliwie największym stopniu, ponieważ wolne grupy tiolowe uległyby w przeciwnym razie utlenieniu do niepożądanych mostków disiarczkowych, co obniża wydajność ligacji. Po zakończeniu ligacji następuje zwykle dodatkowy etap oczyszczania metodą preparatywnej RP-HPLC, który oddziela nieprzereagowany fragment od produktu ligacji.
Dlaczego ma to znaczenie w badaniach dłuższych peptydów
Natywna ligacja chemiczna otworzyła w chemii peptydów drogę do materiału badawczego niedostępnego klasyczną metodą SPPS: dłuższych łańcuchów syntetycznych, a nawet w pełni syntetycznych małych białek, zbudowanych z fragmentów, z których każdy można dobrze skontrolować i oczyścić osobno. Dla laboratoriów pracujących z tego rodzaju konstruktami oznacza to dodatkową warstwę planowania — które fragmenty, które miejsca ligacji, jaka kolejność — oprócz syntezy i oczyszczania potrzebnych już dla każdego pojedynczego fragmentu.
Niniejsze informacje są przeznaczone wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych. Produkty i informacje Dutch Peptide Labs nie są przeznaczone do stosowania u ludzi ani zwierząt, ani do zastosowań diagnostycznych lub terapeutycznych.
