Co sprawia, że reakcja należy do „chemii click”?

Chemia click to zbiorcze określenie klasy reakcji chemicznych, które przebiegają szybko, selektywnie i w łagodnych warunkach, z wysoką wydajnością i niewielką ilością niepożądanych produktów ubocznych. Najbardziej znanym wariantem w badaniach peptydów jest cykloaddycja azydek-alkin: grupa azydkowa i grupa alkinowa reagują ze sobą, tworząc stabilny pierścień triazolowy. Dla laboratoriów pracujących z peptydami badawczymi jest to atrakcyjne, ponieważ reakcja jest niewrażliwa na większość grup funkcyjnych obecnych już w peptydzie, takich jak aminy, kwasy karboksylowe i tiole. Dzięki temu można przyłączyć znacznik, sondę lub powierzchnię bez zaburzania reszty struktury peptydu.

CuAAC a SPAAC: z katalizatorem miedziowym lub bez niego

W obrębie cykloaddycji azydek-alkin istnieją dwa główne warianty. Wersja katalizowana miedzią (CuAAC, Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition) jest szybka i niedroga, ale pozostałości miedzi mogą uszkadzać peptydy w procesach oksydacyjnych i trudno je całkowicie usunąć – co jest istotne dla późniejszej kontroli analitycznej. Wariant bez miedzi (SPAAC, strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) wykorzystuje zamiast katalizatora naprężony pierścieniowo cyklooktyn. Reakcja ta przebiega wolniej, ale całkowicie eliminuje zanieczyszczenie metalami, co ma znaczenie, gdy próbka badawcza jest następnie analizowana czułymi metodami detekcji, takimi jak spektrometria mas. W praktyce wybór między tymi wariantami zależy od wymaganej szybkości reakcji, dostępnych odczynników i tolerancji dalszych badań na ślady metali.

Jak grupa azydkowa lub alkinowa trafia do peptydu?

Aby zastosować chemię click, jedna z dwóch grup reaktywnych musi najpierw zostać wprowadzona do peptydu badawczego. Zwykle odbywa się to na jeden z dwóch sposobów. Podczas syntezy Fmoc na fazie stałej można w wybranym wcześniej miejscu sekwencji wbudować nienaturalny aminokwas z łańcuchem bocznym zawierającym grupę azydkową lub alkinową, co daje pełną kontrolę nad położeniem grupy reaktywnej. Alternatywnie istniejącą grupę funkcyjną – zwykle wolną aminę na N-końcu lub łańcuch boczny lizyny – można po syntezie przekształcić chemicznie za pomocą odczynnika wprowadzającego grupę azydkową lub alkinową. Obie drogi mają konsekwencje dla analizy czystości: dodatkowy etap syntezy oznacza zwykle dodatkową rundę oczyszczania metodą HPLC i kontrolowane potwierdzenie prawidłowej masy przed przeprowadzeniem sprzęgania.

Zastosowania chemii click w laboratorium badawczym

W kontekście laboratoryjnym chemia click służy głównie do przyłączania peptydów badawczych do jednostek wykrywalnych lub funkcjonalnych bez wpływu na samą strukturę peptydu. Przykłady z literatury to przyłączanie fluoroforu do badań obrazowych, mocowanie peptydu do nośnika stałego lub powierzchni czujnika w badaniach wiązania oraz tworzenie koniugatów peptyd-polimer w badaniach materiałowych. Ponieważ powstały pierścień triazolowy jest chemicznie bardzo stabilny, wiązanie pozostaje nienaruszone w szerokim zakresie warunków analitycznych i eksperymentalnych, co sprzyja powtarzalności.

Charakterystyka po reakcji sprzęgania

Jak w przypadku każdej modyfikacji peptydu badawczego, charakterystyka po reakcji jest niezbędna. LC-MS potwierdza, czy przesunięcie masy odpowiada oczekiwanemu powstaniu triazolu i czy nadal obecny jest nieprzereagowany materiał wyjściowy. Analityczna chromatografia HPLC pokazuje, czy reakcja koniugacji przebiegła ilościowo, czy też potrzebny jest dodatkowy etap oczyszczania w celu oddzielenia sprzężonego produktu od nieprzekształconego peptydu. W przypadku reakcji CuAAC często sprawdza się również obecność śladowych pozostałości miedzi, na przykład metodą ICP-MS, aby upewnić się, że końcowa próbka nadaje się do zamierzonych dalszych badań.

Podsumowanie

W ciągu dwudziestu lat chemia click stała się standardowym narzędziem chemii biokoniugacji peptydów, właśnie dlatego, że reakcja jest przewidywalna, selektywna i łatwa do scharakteryzowania. Dla laboratoriów łączących peptydy badawcze ze znacznikami, powierzchniami lub innymi jednostkami funkcjonalnymi wybór między CuAAC a SPAAC daje bezpośrednią możliwość wyważenia szybkości i czystości produktu końcowego.

Dutch Peptide Labs dostarcza peptydy badawcze wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych. Nasze produkty i informacje na tej stronie nie są przeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do zastosowań diagnostycznych ani terapeutycznych.