Po syntezie na fazie stałej, odszczepieniu, oczyszczaniu metodą preparatywnej HPLC i liofilizacji peptyd badawczy rzadko jest całkowicie wolny od substancji chemicznych, które umożliwiły proces syntezy i oczyszczania. Oprócz zawartości wody, oznaczanej zwykle metodą miareczkowania Karla Fischera, pozostają śladowe ilości rozpuszczalników organicznych użytych podczas syntezy i obróbki. Chromatografia gazowa (GC) to technika analityczna, za pomocą której laboratoria identyfikują i oznaczają ilościowo te rozpuszczalniki resztkowe, jako uzupełnienie typowej charakterystyki metodami HPLC i MS.
Skąd pochodzą rozpuszczalniki resztkowe
W syntezie Fmoc SPPS jako środowisko reakcji do sprzęgania, etapów przemywania i usuwania grupy Fmoc stosuje się DMF (dimetyloformamid) i NMP (N-metylopirolidon). Po odszczepieniu od żywicy surowy peptyd często zawiera jeszcze śladowe ilości dichlorometanu (DCM), używanego do przemywania żywicy i w niektórych protokołach odszczepiania, oraz kwasu trifluorooctowego (TFA) pochodzącego z samej mieszaniny odszczepiającej. W kolejnym etapie oczyszczania metodą preparatywnej HPLC jako faza ruchoma pojawia się acetonitryl (ACN). Każda z tych substancji może w zmiennych ilościach przetrwać etap liofilizacji, jeśli nie została całkowicie odparowana lub wymieniona.
Klasyfikacja rozpuszczalników: analityczny punkt odniesienia
W chemii analitycznej rozpuszczalniki klasyfikuje się często zgodnie z wytyczną ICH Q3C, która wyróżnia trzy klasy na podstawie profilu toksykologicznego i wynikających z niego progów raportowania. DMF i NMP należą na ogół do klasy 2, podobnie jak DCM; ACN również uznaje się za rozpuszczalnik klasy 2. Ramy te opracowano przede wszystkim dla przemysłu farmaceutycznego, ale laboratoria dokumentujące analitycznie materiał badawczy często stosują tę samą klasyfikację jako punkt odniesienia, aby spójnie raportować poziomy pozostałości i porównywać je między partiami. Jest to analityczno-chemiczny system klasyfikacji do celów dokumentacyjnych, a nie stwierdzenie dotyczące stosowania u ludzi lub zwierząt.
GC z analizą fazy nadpowierzchniowej: jak działa pomiar
W przypadku lotnych rozpuszczalników resztkowych w stałej, liofilizowanej próbce wybiera się zwykle technikę GC z analizą fazy nadpowierzchniowej (headspace GC). Próbkę doprowadza się do ustalonej temperatury w szczelnie zamkniętej fiolce, tak aby lotne składniki rozdzieliły się do fazy gazowej nad próbką zgodnie z ich prężnością par. Określoną objętość tej fazy gazowej wprowadza się następnie automatycznie na kolumnę GC, gdzie zachodzi rozdział na podstawie lotności i polarności. Detekcję prowadzi się detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) do oznaczeń ilościowych lub spektrometrem mas (GC-MS), gdy potrzebna jest identyfikacja nieznanych pików. Dozowanie z fazy nadpowierzchniowej ma tę zaletę, że nielotne składniki matrycy, takie jak sam peptyd, nie obciążają kolumny ani detektora.
Kalibracja i granice oznaczalności
Ilościowa analiza GC fazy nadpowierzchniowej wymaga serii kalibracyjnej o znanych stężeniach każdego oznaczanego rozpuszczalnika, przygotowywanej zwykle w matrycy zbliżonej do rozkładu równowagowego rzeczywistej próbki. Wzorce wewnętrzne korygują zmienność objętości dozowania i równoważenia fazy nadpowierzchniowej. Granica raportowania (granica oznaczalności) dla większości rozpuszczalników klasy 2 jest rzędu kilkudziesięciu do kilkuset ppm, czyli znacznie poniżej tego, co byłoby wykrywalne prostą analizą NMR. Ta czułość ma znaczenie, ponieważ rozpuszczalniki resztkowe, nawet w niewielkich ilościach, mogą wpływać na dokładność grawimetrycznych oznaczeń zawartości peptydu netto, a w niektórych przypadkach dawać sygnały zakłócające w pokrewnych technikach analitycznych.
Dlaczego jest to część pełnej charakterystyki
Dla grup badawczych, które chcą zapewnić powtarzalność między eksperymentami, dokumentowanie rozpuszczalników resztkowych jest logiczną częścią pełnego analitycznego „odcisku palca” partii peptydu, obok czystości (HPLC), tożsamości (MS) i zawartości wody (metoda Karla Fischera). Zmienność zawartości rozpuszczalników resztkowych między partiami może bowiem tłumaczyć niewielkie różnice w zachowaniu pozornie identycznych partii peptydu w dalszych badaniach. Kompletny certyfikat analizy, który podaje również wartości rozpuszczalników resztkowych, daje zatem badaczom pełniejszy obraz materiału, którym dysponują.
Te produkty i informacje są przeznaczone wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych, a nie do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do celów diagnostycznych ani do zastosowań terapeutycznych.
