Ilościowa spektrometria mas odgrywa coraz większą rolę w badaniach związanych z peptydami, od badań proteomicznych po charakterystykę syntetycznych peptydów badawczych. Jednak sygnał LC-MS/MS sam w sobie nie jest wiarygodną miarą stężenia: wydajność jonizacji różni się w zależności od serii pomiarowej, aparatu i matrycy. Peptydy znakowane izotopami stabilnymi (SIL) opracowano właśnie po to, by rozwiązać ten problem. W tym artykule opisano, czym są peptydy SIL, dlaczego stosuje się je w ilościowych procedurach analitycznych i na co zwraca się uwagę przy ich syntezie i kontroli jakości.

Czym są peptydy znakowane izotopami stabilnymi?

Peptyd SIL ma taką samą sekwencję aminokwasów jak badany peptyd, ale w jednej lub kilku pozycjach atomy zostały zastąpione ich ciężkimi, stabilnymi izotopami: ¹³C zamiast ¹²C, ¹⁵N zamiast ¹⁴N lub deuter (²H) zamiast wodoru. Pod względem chemicznym znakowany peptyd zachowuje się niemal identycznie jak wariant nieznakowany: ma ten sam czas retencji w HPLC w układzie faz odwróconych i porównywalną wydajność jonizacji w źródle spektrometru mas. Jedyną różnicą jest masa, która wzrasta o stałą, przewidywalną liczbę daltonów. W detektorze MS znakowany peptyd pojawia się zatem jako oddzielny sygnał, przesunięty względem peptydu endogennego lub syntetycznego, podczas gdy chromatograficznie niemal się z nim pokrywa.

Dlaczego potrzebny jest wzorzec wewnętrzny

W ilościowej analizie LC-MS/MS intensywność sygnału zależy nie tylko od ilości analitu, ale także od efektów matrycy, takich jak supresja jonów, zmienność przygotowania próbki i dryf aparatu między pomiarami. Zewnętrzny punkt kalibracyjny nie koryguje tego w pełni, ponieważ nie uwzględnia tego, co dzieje się w konkretnej próbce. Peptyd SIL dodany do próbki przed ekstrakcją przechodzi dokładnie takie samo przygotowanie próbki, rozdział chromatograficzny i jonizację jak peptyd oznaczany ilościowo. Dzięki obliczeniu stosunku sygnałów między peptydem endogennym a znaną ilością wzorca wewnętrznego wiele z tych zmiennych się znosi. Zasada ta — porównywalna z opisaną w literaturze proteomicznej metodą AQUA (Absolute QUAntification) — umożliwia powtarzalne, bezwzględne oznaczanie ilościowe w złożonych matrycach.

Strategia syntezy: gdzie umieszcza się znacznik?

Peptydy SIL buduje się zwykle metodą syntezy peptydów na fazie stałej (Fmoc-SPPS), wbudowując w jednej lub kilku określonych pozycjach znakowany aminokwas Fmoc zamiast standardowego bloku budulcowego. Wybór pozycji i przesunięcia masy nie jest przypadkowy:

• Przesunięcie masy: utrzymuje się różnicę co najmniej 4–5 Da względem peptydu nieznakowanego, tak aby rozkład izotopowy wzorca nie nakładał się na naturalną obwiednię izotopową peptydu endogennego.
• Pozycja w sekwencji: znakowanie przeprowadza się preferencyjnie na aminokwasach stabilnych podczas syntezy i przechowywania, a nie w pozycjach podatnych na modyfikacje chemiczne (takie jak deamidacja lub utlenianie), aby uniknąć niepożądanych przesunięć masy w trakcie badań.
• Rodzaj znacznika: znakowanie ¹³C i ¹⁵N jest na ogół preferowane względem znakowania deuterem, ponieważ deuter w niektórych pozycjach może ulegać wymianie z rozpuszczalnikiem (wymiana zwrotna) i w ten sposób nieprzewidywalnie przesuwać masę wzorca.

Kontrola jakości: czystość chemiczna i izotopowa

W przypadku peptydów SIL liczy się nie tylko czystość chemiczna — ustalana metodą RP-HPLC i spektrometrii mas, jak w przypadku każdego peptydu badawczego — ale także stopień wzbogacenia izotopowego. Partia znakowanych bloków budulcowych nigdy nie zawiera dokładnie 100% ciężkiego izotopu; niewielki odsetek cząsteczek zawiera lekki, naturalny wariant. Ta czystość izotopowa jest wyrażana w procentach i stanowi odrębną specyfikację w certyfikacie analizy, obok zwykłej czystości chemicznej i zawartości peptydu netto. W badaniach ilościowych mierzących niskie stężenia istotne jest wysokie wzbogacenie izotopowe (zwykle >98%), ponieważ niższe wzbogacenie przyczynia się do sygnału tła w miejscu peptydu endogennego.

Zastosowanie w opublikowanych badaniach

W literaturze proteomicznej i bioanalitycznej peptydy SIL opisuje się jako wzorce wewnętrzne do oznaczania ilościowego docelowych białek i peptydów w złożonych matrycach biologicznych metodą monitorowania wielu reakcji (MRM) lub monitorowania reakcji równoległych (PRM) na aparatach typu potrójny kwadrupol i Orbitrap. Opublikowane walidacje metod zazwyczaj podają liniowość, precyzję i dokładność takich oznaczeń w określonym zakresie stężeń. Publikacje te opisują zastosowanie peptydów SIL w ramach metody badawczej; nie mówią nic o osobistym stosowaniu danych peptydów.

Produkty i informacje Dutch Peptide Labs są przeznaczone wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych. Nie są przeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do zastosowań diagnostycznych ani do zastosowań terapeutycznych.