Γιατί η SPPS δεν κλιμακώνεται απεριόριστα
Η σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση (SPPS) είναι η τυπική μέθοδος για την κατασκευή ερευνητικών πεπτιδίων, κατάλοιπο προς κατάλοιπο, πάνω σε έναν στερεό φορέα ρητίνης. Προηγούμενα άρθρα σε αυτό το ιστολόγιο κάλυψαν τα δομικά στοιχεία αυτής της διεργασίας: τις προστατευτικές ομάδες, την επιλογή ρητίνης, τα αντιδραστήρια σύζευξης και την αποκοπή που απελευθερώνει το ακατέργαστο πεπτίδιο από τη ρητίνη. Αυτό που μένει σιωπηρό σε αυτή την αλυσίδα είναι ότι η SPPS έχει ένα πρακτικό όριο μήκους. Καθώς μια αλυσίδα μεγαλώνει, συσσωρεύονται ατελείς συζεύξεις, αλληλουχίες διαγραφής (deletion sequences) και συσσωμάτωση της αναπτυσσόμενης πεπτιδικής αλυσίδας πάνω στη ρητίνη. Πέρα από περίπου 50 αμινοξέα, η πιθανότητα ενός ομοιογενούς τελικού προϊόντος γίνεται στατιστικά όλο και μικρότερη, ακόμη και με ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο.
Για την έρευνα σε μακρύτερα ερευνητικά πεπτίδια και μικρές πρωτεΐνες, αυτό αποτελεί πραγματική στενωπό. Η λύση που έχει αναπτυχθεί στη βιβλιογραφία δεν είναι μία μακρύτερη σύνθεση, αλλά η χημική ένωση περισσότερων βραχύτερων τμημάτων, καθένα από τα οποία παρασκευάζεται με SPPS. Η πιο διαδεδομένη τεχνική για τον σκοπό αυτό είναι η native chemical ligation (NCL, εγγενής χημική σύνδεση).
Η αρχή της native chemical ligation
Η NCL, που περιγράφηκε αρχικά από την ερευνητική ομάδα του Stephen Kent τη δεκαετία του 1990, χρησιμοποιεί δύο μη προστατευμένα πεπτιδικά τμήματα που αντιδρούν χημειοεκλεκτικά μεταξύ τους σε υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ουδέτερο pH. Το ένα τμήμα φέρει έναν θειοεστέρα στο C-τελικό του άκρο, το άλλο έχει μια ελεύθερη κυστεΐνη στο N-τελικό του άκρο. Επειδή και τα δύο τμήματα είναι εντελώς μη προστατευμένα, δεν απαιτείται ξεχωριστό στάδιο αποπροστασίας μετά την ίδια τη σύνδεση, γεγονός που απλοποιεί σημαντικά τη διεργασία σε σύγκριση με την κλασική συμπύκνωση τμημάτων.
Η αντίδραση εξελίσσεται σε δύο στάδια. Πρώτα πραγματοποιείται μια διαθειοεστεροποίηση: η θειολική ομάδα της κυστεΐνης προσβάλλει τον θειοεστέρα και σχηματίζει ένα νέο, προσωρινό ενδιάμεσο θειοεστέρα στη θέση σύνδεσης. Το ενδιάμεσο αυτό υφίσταται στη συνέχεια μια ενδομοριακή μετατόπιση ακυλίου από S σε N, κατά την οποία η ακυλομάδα μεταναστεύει από το θείο στην αμινομάδα της ίδιας κυστεΐνης. Το αποτέλεσμα είναι ένας εγγενής αμιδικός δεσμός — χημικά αδιάκριτος από έναν πεπτιδικό δεσμό που σχηματίζεται κατά τη συνήθη σύζευξη στη SPPS.
Από δύο τμήματα σε μια μακρύτερη ερευνητική αλυσίδα
Κάθε τμήμα κατασκευάζεται και καθαρίζεται χωριστά μέσω τυπικής Fmoc-SPPS, ακριβώς όπως περιγράφηκε νωρίτερα σε αυτό το ιστολόγιο για βραχύτερα πεπτίδια. Το C-τελικό τμήμα μετατρέπεται σε θειοεστέρα κατά τη διάρκεια ή μετά τη σύνθεση, ενώ το N-τελικό τμήμα του επόμενου τμήματος απαιτεί μια κυστεΐνη στην πρώτη θέση. Για ερευνητικούς σκοπούς που υπερβαίνουν όσα μπορούν να καλύψουν δύο τμήματα — πρωτεΐνες-στόχοι περίπου εκατό έως διακοσίων πενήντα αμινοξέων — πραγματοποιούνται περισσότερες συνδέσεις η μία μετά την άλλη (διαδοχικά) ή ξεκινώντας από ένα κεντρικό τμήμα (συγκλίνουσα στρατηγική). Αυτό απαιτεί αυστηρή σειρά σταδίων αποπροστασίας και σύνδεσης, επειδή κάθε τμήμα επιτρέπεται να δράσει ως αντιδρών εταίρος μόνο μία φορά πριν έρθει η σειρά της επόμενης σύζευξης.
Πρακτικοί περιορισμοί στην ερευνητική πράξη
Ο μεγαλύτερος πρακτικός περιορισμός της κλασικής NCL είναι η απαίτηση για μια κυστεΐνη σε κάθε θέση σύνδεσης. Δεν έχει κάθε ερευνητική αλληλουχία φυσικά μια κυστεΐνη σε εκείνο το σημείο, και η ενσωμάτωση μιας επιπλέον κυστεΐνης μπορεί να μεταβάλει τις ιδιότητες του αντικειμένου μελέτης. Για τον λόγο αυτό η βιβλιογραφία περιγράφει αφαιρούμενες θειολικές βοηθητικές ομάδες και τροποποιημένα αμινοξέα που μιμούνται τη δραστικότητα της κυστεΐνης και μπορούν να απομακρυνθούν ξανά μετά τη σύνδεση, ώστε να διατηρείται η αρχική αλληλουχία.
Οι συνθήκες αντίδρασης είναι εξίσου κρίσιμες. Το ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης διατηρείται συνήθως σε pH 7 και περιέχει έναν θειολικό καταλύτη, όπως το MPAA, ο οποίος επιταχύνει την ανταλλαγή θειοεστέρα και εμποδίζει τη στασιμότητα του ενδιαμέσου. Το οξυγόνο αποκλείεται όσο το δυνατόν περισσότερο, επειδή διαφορετικά οι ελεύθερες θειολικές ομάδες θα οξειδώνονταν σε ανεπιθύμητες δισουλφιδικές γέφυρες, μειώνοντας την απόδοση της σύνδεσης. Μόλις ολοκληρωθεί η σύνδεση, ακολουθεί συνήθως ένα επιπλέον στάδιο καθαρισμού μέσω παρασκευαστικής RP-HPLC, το οποίο διαχωρίζει το τμήμα που δεν αντέδρασε από το προϊόν της σύνδεσης.
Γιατί αυτό έχει σημασία για την έρευνα σε μακρύτερα πεπτίδια
Η native chemical ligation άνοιξε τον δρόμο στη χημεία πεπτιδίων προς ερευνητικό υλικό που ήταν απρόσιτο μέσω της κλασικής SPPS: μακρύτερες συνθετικές αλυσίδες και ακόμη και πλήρως συνθετικές μικρές πρωτεΐνες, κατασκευασμένες από κομμάτια καθένα από τα οποία μπορεί να ελεγχθεί και να καθαριστεί καλά από μόνο του. Για τα εργαστήρια που εργάζονται με τέτοιου είδους κατασκευές, αυτό σημαίνει ένα επιπλέον επίπεδο σχεδιασμού — ποια τμήματα, ποιες θέσεις σύνδεσης, ποια σειρά — πέρα από τη σύνθεση και τον καθαρισμό που ήδη απαιτούνται για κάθε μεμονωμένο τμήμα.
Οι πληροφορίες αυτές προορίζονται αποκλειστικά για εργαστηριακούς και ερευνητικούς σκοπούς. Τα προϊόντα και οι πληροφορίες της Dutch Peptide Labs δεν προορίζονται για χρήση από ανθρώπους ή ζώα, ούτε για διαγνωστικές ή θεραπευτικές εφαρμογές.
