Δεν διαλύεται κάθε ερευνητικό πεπτίδιο εξίσου εύκολα. Ενώ ορισμένες αλληλουχίες διαλύονται σε νερό δίνοντας διαυγές διάλυμα μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα, άλλες παραμένουν επίμονα θολές, σχηματίζουν συσσωματώματα ή ακόμη και καθιζάνουν στο τοίχωμα του σωληναρίου. Για τα εργαστήρια που εργάζονται με πεπτίδια αυτό δεν είναι αισθητικό αλλά πρακτικό πρόβλημα: ένα κακώς διαλυμένο πυκνό διάλυμα (stock) δίνει αναξιόπιστες συγκεντρώσεις και προβλήματα αναπαραγωγιμότητας σε μεταγενέστερα στάδια της ερευνητικής διαδικασίας. Η αιτία βρίσκεται συχνά στη σύσταση αμινοξέων του ίδιου του πεπτιδίου, και η λύση σε μια μελετημένη επιλογή διαλύτη.
Γιατί ορισμένα πεπτίδια διαλύονται δύσκολα
Η διαλυτότητα ενός πεπτιδίου καθορίζεται από την ισορροπία μεταξύ υδρόφιλων (που έλκουν το νερό) και υδρόφοβων (που απωθούν το νερό) καταλοίπων αμινοξέων στην αλυσίδα. Αμινοξέα όπως η λευκίνη, η ισολευκίνη, η βαλίνη, η φαινυλαλανίνη και η τρυπτοφάνη έχουν πλευρικές αλυσίδες που απωθούν το νερό. Όταν μια αλληλουχία περιέχει μεγάλη αναλογία τέτοιων καταλοίπων, ή όταν αυτά εμφανίζονται συγκεντρωμένα αντί να κατανέμονται κατά μήκος της αλυσίδας, το πεπτίδιο σε υδατικό περιβάλλον συχνά αναδιπλώνεται σε συμπαγείς, δυσπρόσιτες δομές. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται συσσωμάτωση και είναι ο συχνότερος λόγος για τον οποίο ένα πεπτίδιο στην πράξη δεν διαλύεται όπως θα αναμενόταν με βάση μόνο το μοριακό βάρος.
Εκτίμηση της υδροφοβικότητας πριν από την ανασύσταση
Πριν επιλεγεί διαλύτης, είναι χρήσιμο να αξιολογηθεί η αλληλουχία ως προς την υδροφοβικότητα. Διάφορες κλίμακες υδροφοβικότητας, όπως εκείνες των Kyte-Doolittle ή Eisenberg, αποδίδουν σε κάθε αμινοξύ μια τιμή με βάση την ενέργεια που απαιτείται για τη μεταφορά του καταλοίπου από υδατικό σε μη υδατικό περιβάλλον. Ένα πεπτίδιο με υψηλή μέση βαθμολογία ή με ένα μακρύ συνεχές υδρόφοβο τμήμα απαιτεί σχεδόν πάντα προσαρμοσμένη προσέγγιση στην ανασύσταση. Η αξιολόγηση αυτή διαρκεί λίγα λεπτά με ελεύθερα διαθέσιμα υπολογιστικά εργαλεία και αποτρέπει αρκετές δοκιμές και λάθη στον πάγκο εργασίας.
Επιλογή διαλύτη στην πράξη
Για τα περισσότερα υδρόφιλα πεπτίδια, απεσταγμένο νερό ή ένα αραιό όξινο διάλυμα όπως οξικό οξύ 0,1% αρκεί για να διευκολύνει τη διάλυση και να επιβραδύνει την ανάπτυξη μικροβίων. Σε πιο υδρόφοβες αλληλουχίες αυτό συχνά δεν δίνει επαρκή αποτελέσματα. Συνήθεις εναλλακτικές σε ερευνητικά περιβάλλοντα είναι:
- DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο): ένας απρωτικός διαλύτης που επιδιαλυτώνει καλά τόσο πολικές όσο και άπολες ομάδες, κατάλληλος για έντονα υδρόφοβα πεπτίδια, αν και μπορεί να παρεμβαίνει σε ορισμένες δοκιμασίες.
- Μείγματα ακετονιτριλίου/νερού: χρησιμοποιούνται συχνά σε συνδυασμό με μικρό ποσοστό TFA (τριφθοροοξικό οξύ), αντίστοιχα με την κινητή φάση στον καθαρισμό με HPLC.
- Αραιή αμμωνία ή NaOH: χρήσιμα για πεπτίδια με υπεροχή όξινων καταλοίπων, όπου ένα ελαφρώς βασικό περιβάλλον βελτιώνει το φορτίο και επομένως τη διαλυτότητα.
Μια συνήθης εργαστηριακή πρακτική είναι να προστίθεται πρώτα μια μικρή ποσότητα διαλύτη, να ακολουθεί σύντομη ανάδευση σε vortex ή υπέρηχους, και μόνο μετά να γίνεται περαιτέρω αραίωση με το τελικό ρυθμιστικό διάλυμα. Η υπερβολικά γρήγορη αραίωση με νερό αφού ένα πεπτίδιο έχει διαλυθεί σε DMSO μπορεί και πάλι να οδηγήσει σε καθίζηση.
Ο ρόλος του pH και του καθαρού φορτίου
Εκτός από την υδροφοβικότητα, μεγάλο ρόλο παίζει το καθαρό φορτίο του πεπτιδίου. Γύρω από το ισοηλεκτρικό σημείο (pI) ενός πεπτιδίου το καθαρό φορτίο είναι μηδέν, και ακριβώς εκεί η διαλυτότητα είναι συνήθως η χαμηλότερη, επειδή δεν υπάρχει ηλεκτροστατική άπωση μεταξύ των μορίων που να αντισταθμίζει τη συσσωμάτωση. Μετατοπίζοντας σκόπιμα το pH του διαλύματος μακριά από το pI, μέσω ενός ελαφρώς όξινου ή ελαφρώς βασικού ρυθμιστικού διαλύματος ανάλογα με την αλληλουχία, η διαλυτότητα μπορεί συχνά να βελτιωθεί σημαντικά χωρίς να χρειάζονται οργανικοί διαλύτες.
Αναγνώριση και πρόληψη της συσσωμάτωσης και της θολότητας
Ένα διάλυμα που φαίνεται διαυγές δεν είναι πάντα πλήρως ομοιογενές. Τα μικροσυσσωματώματα μπορεί να είναι οπτικά αδιόρατα και παρ’ όλα αυτά να επηρεάζουν την πραγματική συγκέντρωση σε ένα δείγμα. Πρακτικά μέτρα για τον περιορισμό τους είναι: η εργασία σε θερμοκρασία δωματίου κατά τη διάλυση (το κρύο επιβραδύνει την επιδιαλύτωση), η σύντομη αλλά όχι υπερβολική εφαρμογή υπερήχων και η αποφυγή επαναλαμβανόμενων κύκλων κατάψυξης-απόψυξης σε πυκνά διαλύματα (stock). Όταν η θολότητα επιμένει, η διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 µm χαμηλής δέσμευσης πρωτεϊνών μπορεί να αποτελέσει λύση, αν και αυτό μερικές φορές συνοδεύεται από μικρή απώλεια υλικού λόγω προσρόφησης στη μεμβράνη του φίλτρου.
Συμπερασματικά
Η διαλυτότητα δεν είναι δευτερεύον ζήτημα κατά την εργασία με ερευνητικά πεπτίδια, αλλά μια μεταβλητή που πρέπει να αξιολογείται εξίσου προσεκτικά με την καθαρότητα ή το μοριακό βάρος. Εκτιμώντας εκ των προτέρων την υδροφοβικότητα μιας αλληλουχίας και προσαρμόζοντας τον διαλύτη σε αυτήν, τα εργαστήρια αποφεύγουν τον χαμένο χρόνο και τα αναξιόπιστα πυκνά διαλύματα σε μεταγενέστερα στάδια της διαδικασίας.
Οι πληροφορίες αυτές και τα προϊόντα της Dutch Peptide Labs προορίζονται αποκλειστικά για εργαστηριακούς και ερευνητικούς σκοπούς. Δεν προορίζονται για ανθρώπινη ή ζωική κατανάλωση, διαγνωστική χρήση ή θεραπευτική εφαρμογή.
