Μετά τη σύνθεση σε στερεά φάση, την αποκοπή, τον καθαρισμό με παρασκευαστική HPLC και τη λυοφιλοποίηση, ένα ερευνητικό πεπτίδιο σπάνια είναι εντελώς απαλλαγμένο από τις χημικές ουσίες που κατέστησαν δυνατή τη διεργασία σύνθεσης και καθαρισμού. Εκτός από την περιεκτικότητα σε νερό, που προσδιορίζεται συνήθως με ογκομέτρηση Karl Fischer, παραμένουν ίχνη των οργανικών διαλυτών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη σύνθεση και την κατεργασία. Η αέρια χρωματογραφία (GC) είναι η αναλυτική τεχνική με την οποία τα εργαστήρια ταυτοποιούν και ποσοτικοποιούν αυτούς τους υπολειμματικούς διαλύτες, ως συμπλήρωμα του συνήθους χαρακτηρισμού με HPLC και MS.
Από πού προέρχονται οι υπολειμματικοί διαλύτες
Στη Fmoc SPPS, το DMF (διμεθυλοφορμαμίδιο) και το NMP (N-μεθυλοπυρρολιδόνη) χρησιμοποιούνται ως μέσο αντίδρασης για τη σύζευξη, τα στάδια έκπλυσης και την αποπροστασία Fmoc. Μετά την αποκοπή από τη ρητίνη, το ακατέργαστο πεπτίδιο περιέχει συχνά ακόμη ίχνη διχλωρομεθανίου (DCM), που χρησιμοποιείται σε εκπλύσεις της ρητίνης και σε ορισμένα πρωτόκολλα αποκοπής, καθώς και τριφθοροοξικού οξέος (TFA) από το ίδιο το μείγμα αποκοπής. Στον επακόλουθο καθαρισμό με παρασκευαστική HPLC, το ακετονιτρίλιο (ACN) υπεισέρχεται ως κινητή φάση. Καθεμία από αυτές τις ουσίες μπορεί, σε μεταβλητές ποσότητες, να επιβιώσει από το στάδιο της λυοφιλοποίησης, αν δεν έχει εξατμιστεί ή ανταλλαγεί πλήρως.
Ταξινόμηση των διαλυτών: ένα αναλυτικό πλαίσιο αναφοράς
Στην αναλυτική χημεία, οι διαλύτες ταξινομούνται συχνά σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή ICH Q3C, η οποία διακρίνει τρεις κατηγορίες με βάση το τοξικολογικό προφίλ και τα όρια αναφοράς που προκύπτουν από αυτό. Το DMF και το NMP ανήκουν γενικά στην κατηγορία 2, όπως και το DCM· το ACN θεωρείται επίσης διαλύτης κατηγορίας 2. Το πλαίσιο αυτό αναπτύχθηκε κυρίως για τη φαρμακευτική βιομηχανία, όμως εργαστήρια που τεκμηριώνουν αναλυτικά ερευνητικό υλικό χρησιμοποιούν συχνά την ίδια ταξινόμηση ως σημείο αναφοράς, ώστε να αναφέρουν τα υπολειμματικά επίπεδα με συνέπεια και να τα συγκρίνουν μεταξύ παρτίδων. Πρόκειται για ένα αναλυτικοχημικό σύστημα ταξινόμησης για σκοπούς τεκμηρίωσης και όχι για δήλωση σχετικά με χρήση σε ανθρώπους ή ζώα.
Headspace GC: πώς λειτουργεί η μέτρηση
Για πτητικούς υπολειμματικούς διαλύτες σε ένα στερεό, λυοφιλοποιημένο δείγμα επιλέγεται συνήθως η headspace GC (ανάλυση υπερκείμενου αερίου). Το δείγμα φέρεται σε σταθερή θερμοκρασία μέσα σε ένα σφραγισμένο φιαλίδιο, ώστε τα πτητικά συστατικά να κατανέμονται στην αέρια φάση πάνω από το δείγμα ανάλογα με την τάση ατμών τους. Ένας καθορισμένος όγκος αυτής της αέριας φάσης εγχέεται στη συνέχεια αυτόματα στη στήλη GC, όπου ο διαχωρισμός γίνεται με βάση την πτητικότητα και την πολικότητα. Η ανίχνευση πραγματοποιείται με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID) για την ποσοτικοποίηση ή με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) όταν απαιτείται ταυτοποίηση άγνωστων κορυφών. Η έγχυση headspace έχει το πλεονέκτημα ότι τα μη πτητικά συστατικά της μήτρας, όπως το ίδιο το πεπτίδιο, δεν επιβαρύνουν τη στήλη και τον ανιχνευτή.
Βαθμονόμηση και όρια ποσοτικοποίησης
Η ποσοτική headspace GC απαιτεί μια σειρά βαθμονόμησης με γνωστές συγκεντρώσεις κάθε διαλύτη-στόχου, που παρασκευάζεται συνήθως σε μια μήτρα η οποία προσεγγίζει την κατανομή ισορροπίας του πραγματικού δείγματος. Τα εσωτερικά πρότυπα διορθώνουν τη διακύμανση στον όγκο έγχυσης και στην εξισορρόπηση του headspace. Το όριο αναφοράς (όριο ποσοτικοποίησης) για τους περισσότερους διαλύτες κατηγορίας 2 είναι της τάξης μερικών δεκάδων έως εκατοντάδων ppm, πολύ κάτω από ό,τι θα ήταν ανιχνεύσιμο με απλή ανάλυση NMR. Η ευαισθησία αυτή έχει σημασία, επειδή οι υπολειμματικοί διαλύτες, ακόμη και σε μικρές ποσότητες, μπορούν να επηρεάσουν την ακρίβεια των σταθμικών προσδιορισμών της καθαρής περιεκτικότητας σε πεπτίδιο και σε ορισμένες περιπτώσεις να δώσουν παρεμβαλλόμενα σήματα σε συναφείς αναλυτικές τεχνικές.
Γιατί αυτό αποτελεί μέρος του πλήρους χαρακτηρισμού
Για τις ερευνητικές ομάδες που θέλουν να διασφαλίσουν την αναπαραγωγιμότητα μεταξύ πειραμάτων, η τεκμηρίωση των υπολειμματικών διαλυτών είναι λογικό μέρος του πλήρους αναλυτικού αποτυπώματος μιας παρτίδας πεπτιδίου, μαζί με την καθαρότητα (HPLC), την ταυτότητα (MS) και την περιεκτικότητα σε νερό (Karl Fischer). Η διακύμανση των υπολειμματικών διαλυτών από παρτίδα σε παρτίδα μπορεί άλλωστε να εξηγήσει μικρές διαφορές συμπεριφοράς μεταξύ φαινομενικά πανομοιότυπων παρτίδων πεπτιδίου σε μεταγενέστερη έρευνα. Ένα πλήρες Πιστοποιητικό Ανάλυσης που αναφέρει επίσης τιμές υπολειμματικών διαλυτών δίνει επομένως στους ερευνητές μια πληρέστερη εικόνα του υλικού που έχουν στα χέρια τους.
Τα προϊόντα και οι πληροφορίες αυτές προορίζονται αποκλειστικά για εργαστηριακούς και ερευνητικούς σκοπούς και όχι για κατανάλωση από ανθρώπους ή ζώα, για διαγνωστική χρήση ή για θεραπευτική εφαρμογή.
