Antes de seguir analizando una muestra de investigación —por HPLC, espectrometría de masas o en un ensayo funcional—, hay que establecer una cifra básica: la concentración real del péptido en solución. Una etiqueta o un certificado de análisis indica la cantidad en el momento del envasado, pero la reconstitución, la dilución y los pasos de pipeteo introducen incertidumbre. La espectrofotometría UV-Vis a 280 nm es uno de los métodos de laboratorio más utilizados para comprobar esa concentración de forma rápida y no destructiva.

El principio: la ley de Beer-Lambert

La determinación de la concentración por UV-Vis se basa en la ley de Beer-Lambert, que relaciona la absorbancia de una solución con la concentración de la sustancia disuelta:

A = ε × c × l

Aquí, A es la absorbancia medida, ε el coeficiente de extinción molar (en M⁻¹cm⁻¹), c la concentración molar y l el paso óptico de la cubeta en centímetros (normalmente 1 cm). Una vez conocido el ε de un péptido concreto, basta una sola medida de absorbancia para calcular la concentración.

¿Por qué precisamente 280 nm?

A 280 nm absorben principalmente las cadenas laterales aromáticas del triptófano (Trp) y la tirosina (Tyr), con una contribución menor de la cisteína unida por puentes disulfuro (cistina). La fenilalanina apenas absorbe a esta longitud de onda. Esto implica de inmediato la principal limitación del método: un péptido sin Trp, Tyr ni puentes disulfuro genera poca o ninguna señal a 280 nm, sea cual sea su concentración real. Para estas secuencias, la A280 sencillamente no es utilizable y hay que buscar un método alternativo.

Cálculo del coeficiente de extinción

Para un péptido de secuencia de aminoácidos conocida, el ε puede estimarse teóricamente sumando las contribuciones individuales de los residuos aromáticos. Los valores de referencia habituales a 280 nm son:

• Triptófano: aproximadamente 5500 M⁻¹cm⁻¹
• Tirosina: aproximadamente 1490 M⁻¹cm⁻¹
• Cistina (par de cisteínas unidas por un puente disulfuro): aproximadamente 125 M⁻¹cm⁻¹

La suma de estas contribuciones, multiplicadas por el número de veces que aparece cada residuo en la secuencia, da un ε teórico. Este valor estimado difiere a veces del coeficiente de extinción real determinado experimentalmente, en parte por efectos conformacionales locales. Por ello, para una investigación cuantitativa exacta es preferible un ε validado experimentalmente a un valor puramente calculado.

Consideraciones prácticas para la medida

En la práctica de la investigación, varios factores influyen en la fiabilidad de una medida de A280:

• Turbidez y agregación: la dispersión de la luz por partículas no disueltas aumenta la absorbancia aparente y distorsiona la concentración calculada.
• Interferencia del tampón: algunos componentes del tampón, estabilizantes o restos de disolvente absorben a 280 nm o cerca de esa longitud de onda y deben tenerse en cuenta mediante una medida del blanco.
• Calidad de la cubeta y paso óptico: se necesitan cubetas de cuarzo o de plástico transparente al UV con un paso óptico controlado; las cubetas de vidrio corriente o de poliestireno estándar no transmiten suficientemente la luz UV.
• Intervalo de trabajo del instrumento: con una absorbancia demasiado alta (normalmente por encima de A ≈ 1,5) el detector se satura, lo que obliga a diluir antes de medir.

Cuándo se necesita un método alternativo

Para péptidos sin residuos aromáticos, en la práctica de la investigación se recurre a menudo a la absorción a 205–214 nm, basada en el propio enlace peptídico, o a ensayos colorimétricos como el BCA o el de Bradford, que reaccionan con grupos químicos concretos del péptido. Cada método tiene su propia sensibilidad, su perfil de interferencias y el volumen inicial que requiere, y la elección depende de la secuencia, de la cantidad de muestra disponible y de la exactitud necesaria. La cuantificación por espectrometría de masas, tratada anteriormente en este blog, sigue siendo además un punto de referencia para comprobar la identidad junto con la determinación de la concentración.

Pese a estas limitaciones, la espectrofotometría UV-Vis sigue siendo apreciada en los laboratorios de investigación por su rapidez, su carácter no destructivo y su bajo coste por medida. Una interpretación cuidadosa —atendiendo a la composición de la secuencia, al fondo del tampón y a la calibración del instrumento— sigue siendo esencial para obtener resultados fiables.

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