Tras la síntesis en fase sólida, la escisión, la purificación por HPLC preparativa y la liofilización, un péptido de investigación rara vez está completamente libre de los productos químicos que hicieron posible el proceso de síntesis y purificación. Además del contenido de agua, que suele determinarse mediante valoración de Karl Fischer, quedan trazas de los disolventes orgánicos utilizados durante la síntesis y el procesado posterior. La cromatografía de gases (GC) es la técnica analítica con la que los laboratorios identifican y cuantifican estos disolventes residuales, como complemento de la caracterización habitual por HPLC y MS.
De dónde proceden los disolventes residuales
En la Fmoc-SPPS, la DMF (dimetilformamida) y la NMP (N-metilpirrolidona) se utilizan como medio de reacción para el acoplamiento, los pasos de lavado y la desprotección del Fmoc. Tras la escisión de la resina, el péptido bruto contiene a menudo todavía trazas de diclorometano (DCM), que se utiliza en los lavados de la resina y en algunos protocolos de escisión, y de ácido trifluoroacético (TFA) procedente del propio cóctel de escisión. En la posterior purificación por HPLC preparativa entra en juego el acetonitrilo (ACN) como fase móvil. Cada una de estas sustancias puede sobrevivir, en cantidades variables, a la etapa de liofilización si no se ha evaporado o intercambiado por completo.
Clasificación de los disolventes: un marco de referencia analítico
En química analítica, los disolventes se clasifican a menudo según la directriz ICH Q3C, que distingue tres clases en función del perfil toxicológico y de los umbrales de notificación que se derivan de él. La DMF y la NMP pertenecen por lo general a la clase 2, al igual que el DCM; el ACN también se considera un disolvente de clase 2. Este marco se desarrolló principalmente para la industria farmacéutica, pero los laboratorios que documentan analíticamente material de investigación utilizan a menudo la misma clasificación como punto de referencia para notificar los niveles residuales de forma coherente y compararlos entre lotes. Se trata de un sistema de clasificación químico-analítico con fines de documentación, no de una afirmación sobre el uso en personas o animales.
GC de espacio de cabeza: cómo funciona la medición
Para los disolventes residuales volátiles en una muestra sólida liofilizada, suele elegirse la GC de espacio de cabeza (headspace). La muestra se lleva a una temperatura fija en un vial cerrado, de modo que los componentes volátiles se distribuyen en la fase gaseosa situada sobre la muestra según su presión de vapor. A continuación, un volumen definido de esa fase gaseosa se inyecta automáticamente en la columna de GC, donde la separación se produce en función de la volatilidad y la polaridad. La detección se realiza con un detector de ionización de llama (FID) para la cuantificación, o con un espectrómetro de masas (GC-MS) cuando es necesario identificar picos desconocidos. La inyección de espacio de cabeza tiene la ventaja de que los componentes no volátiles de la matriz, como el propio péptido, no sobrecargan la columna ni el detector.
Calibración y límites de cuantificación
La GC de espacio de cabeza cuantitativa requiere una serie de calibración con concentraciones conocidas de cada disolvente diana, preparada normalmente en una matriz que se aproxime a la distribución de equilibrio de la muestra real. Los patrones internos corrigen la variación del volumen de inyección y del equilibrado del espacio de cabeza. El límite de notificación (límite de cuantificación) para la mayoría de los disolventes de clase 2 es del orden de unas decenas a cientos de ppm, muy por debajo de lo que sería detectable con un simple análisis por RMN. Esta sensibilidad es relevante porque los disolventes residuales, incluso en pequeñas cantidades, pueden afectar a la exactitud de las determinaciones gravimétricas del contenido neto de péptido y, en algunos casos, generar señales interferentes en técnicas analíticas relacionadas.
Por qué forma parte de una caracterización completa
Para los grupos de investigación que quieren garantizar la reproducibilidad entre experimentos, documentar los disolventes residuales es una parte lógica de la huella analítica completa de un lote de péptido, junto con la pureza (HPLC), la identidad (MS) y el contenido de agua (Karl Fischer). Al fin y al cabo, la variación entre lotes de los disolventes residuales puede explicar pequeñas diferencias de comportamiento entre lotes de péptido aparentemente idénticos en investigaciones posteriores. Un certificado de análisis completo que indique también los valores de disolventes residuales ofrece, por tanto, a los investigadores una imagen más completa del material que tienen entre manos.
Estos productos y esta información están destinados exclusivamente a fines de laboratorio e investigación, y no al consumo humano ni animal, ni a uso diagnóstico ni a aplicación terapéutica.
