Warum die SPPS nicht unbegrenzt skaliert
Die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) ist die Standardmethode, um Forschungspeptide Rest für Rest auf einem festen Harzträger aufzubauen. Frühere Artikel in diesem Blog behandelten die Bausteine dieses Prozesses: Schutzgruppen, Harzwahl, Kupplungsreagenzien und die Abspaltung, die das Rohpeptid vom Harz freisetzt. Implizit bleibt in dieser Kette, dass die SPPS eine praktische Längenbegrenzung hat. Je länger eine Kette wächst, desto mehr häufen sich unvollständige Kupplungen, Deletionssequenzen und Aggregation der wachsenden Peptidkette am Harz. Jenseits von etwa 50 Aminosäuren wird die Wahrscheinlichkeit eines homogenen Endprodukts statistisch immer geringer, selbst mit einem optimierten Protokoll.
Für die Forschung an längeren Forschungspeptiden und kleinen Proteinen ist das ein echter Engpass. Die in der Literatur erarbeitete Lösung ist nicht eine längere Synthese, sondern das chemische Verbinden mehrerer kürzerer Fragmente, die jeweils per SPPS hergestellt werden. Die dafür am weitesten verbreitete Technik ist die native chemische Ligation (NCL).
Das Prinzip der nativen chemischen Ligation
Die NCL, ursprünglich in den 1990er Jahren von der Forschungsgruppe um Stephen Kent beschrieben, nutzt zwei ungeschützte Peptidfragmente, die in wässrigem Puffer bei neutralem pH-Wert chemoselektiv miteinander reagieren. Ein Fragment trägt an seinem C-Terminus einen Thioester, das andere hat an seinem N-Terminus ein freies Cystein. Da beide Fragmente vollständig ungeschützt sind, ist nach der Ligation selbst kein separater Entschützungsschritt erforderlich, was den Prozess im Vergleich zur klassischen Fragmentkondensation deutlich vereinfacht.
Die Reaktion läuft in zwei Schritten ab. Zunächst findet eine Transthioesterifizierung statt: Die Thiolgruppe des Cysteins greift den Thioester an und bildet an der Ligationsstelle einen neuen, temporären Thioester als Zwischenprodukt. Dieses Zwischenprodukt durchläuft anschließend eine intramolekulare S→N-Acylwanderung, bei der die Acylgruppe vom Schwefel auf die Aminogruppe desselben Cysteins wandert. Das Ergebnis ist eine native Amidbindung – chemisch nicht von einer Peptidbindung zu unterscheiden, die bei einer gewöhnlichen SPPS-Kupplung entsteht.
Von zwei Fragmenten zu einer längeren Forschungskette
Jedes Fragment wird separat per Standard-Fmoc-SPPS aufgebaut und aufgereinigt, genau wie in diesem Blog zuvor für kürzere Peptide beschrieben. Das C-terminale Fragment wird während oder nach der Synthese in einen Thioester umgewandelt, während das N-terminale Fragment des nächsten Segments ein Cystein an der ersten Position benötigt. Für Forschungszwecke, die über das hinausgehen, was zwei Fragmente abdecken können – Zielproteine von etwa einhundert bis zweihundertfünfzig Aminosäuren –, werden mehrere Ligationen hintereinander (sequenziell) oder von einem zentralen Fragment aus (konvergent) durchgeführt. Das erfordert eine strikte Reihenfolge von Entschützungs- und Ligationsschritten, denn jedes Fragment darf nur einmal als reaktiver Partner auftreten, bevor die nächste Kupplung an die Reihe kommt.
Praktische Einschränkungen in der Forschungspraxis
Die größte praktische Einschränkung der klassischen NCL ist das Erfordernis eines Cysteins an jeder Ligationsstelle. Nicht jede Forschungssequenz hat dort von Natur aus ein Cystein, und der Einbau eines zusätzlichen Cysteins kann die Eigenschaften des Untersuchungsobjekts verändern. Die Literatur beschreibt daher entfernbare Thiol-Hilfsgruppen und modifizierte Aminosäuren, die die Reaktivität von Cystein nachahmen und nach der Ligation wieder entfernt werden können, sodass die ursprüngliche Sequenz erhalten bleibt.
Die Reaktionsbedingungen sind ebenso kritisch. Der Ligationspuffer wird üblicherweise bei pH 7 gehalten und enthält einen Thiolkatalysator wie MPAA, der den Thioesteraustausch beschleunigt und verhindert, dass das Zwischenprodukt stehen bleibt. Sauerstoff wird so weit wie möglich ausgeschlossen, da freie Thiolgruppen sonst zu unerwünschten Disulfidbrücken oxidieren und die Ligationsausbeute senken würden. Nach Abschluss der Ligation folgt in der Regel ein weiterer Aufreinigungsschritt per präparativer RP-HPLC, der nicht umgesetztes Fragment vom Ligationsprodukt trennt.
Warum dies für die Forschung an längeren Peptiden wichtig ist
Die native chemische Ligation hat in der Peptidchemie die Tür zu Forschungsmaterial geöffnet, das über die klassische SPPS nicht zugänglich war: längere synthetische Ketten und sogar vollständig synthetische kleine Proteine, aufgebaut aus Teilstücken, von denen jedes für sich gut geprüft und aufgereinigt werden kann. Für Labore, die mit derartigen Konstrukten arbeiten, bedeutet das eine zusätzliche Planungsebene – welche Fragmente, welche Ligationsstellen, welche Reihenfolge – über die Synthese und Aufreinigung hinaus, die für jedes einzelne Fragment ohnehin erforderlich ist.
Diese Informationen sind ausschließlich für Labor- und Forschungszwecke bestimmt. Die Produkte und Informationen von Dutch Peptide Labs sind nicht zur Anwendung am Menschen oder Tier und nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.
